O que é a Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR)?

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1 O que é a Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR)?

2 O que é a Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR)? 3 5 F R 3 5 Um processo para multiplicar selectivamente um determinado segmento de DNA Esse segmento pode representar uma pequena parte de uma mistura complexa de DNAs (por ex. um determinado exão numa preparação de DNA genómico total) Através da PCR podemos obter uma quantidade abundante de DNA em cerca de 2 horas A preparação de DNA alvo não precisa ser pura Pode amplificar-se uma única cópia de DNA alvo (por ex. uma sequência específica em uma única célula haplóide)

3 Os componentes chave da Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) já eram todos conhecidos previamente, só faltando juntar as peças do puzzle

4 Os componentes chave da Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) já eram todos conhecidos previamente, só faltando juntar as peças do puzzle The eureka enzyme: the discovery of DNA polymerase Abstract The identification and partial purification by Arthur Kornberg and his colleagues in 1956 of an enzyme - DNA polymerase I of Escherichia coli - that catalyzed the stable incorporation of deoxyribonucleotides into DNA in vitro came as a surprise. At the time, most scientists in the field believed that DNA synthesis was too complicated to be accurately reflected outside the living cell.

5 Os componentes chave da Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) já eram todos conhecidos previamente, só faltando juntar as peças do puzzle In the early 1960s H. Gobind Khorana participates in the discovery of the Genetic Code. Afterwards, he initiates a large project to totally synthesize a functional human gene. To achieve this, he pioneers many of the techniques needed to make and use synthetic DNA oligonucleotides. Sequence-specific oligos are used both as building blocks for the gene, and as primers and templates for DNA polymerase. In 1968 Khorana is awarded the Nobel Prize for his work on the Genetic Code.

6 Os componentes chave da Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) já eram todos conhecidos previamente, só faltando juntar as peças do puzzle

7 Os componentes chave da Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) já eram todos conhecidos previamente, só faltando juntar as peças do puzzle In 1977 Frederick Sanger reports a method for determining the sequence of DNA. The technique involves an oligonucleotide primer, DNA polymerase, and modified nucleotide precursors that block further extension of the primer in sequence-dependent manner. He is awarded the Nobel Prize in 1980.

8 Os componentes chave da Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) já eram todos conhecidos previamente, só faltando juntar as peças do puzzle Later in 1983 Mullis begins to test his idea. His first experiment[2] does not involve thermal cycling - he hopes that the polymerase can perform continued replication on its own. Later experiments that year do involve repeated thermal cycling, and target small segments of a cloned gene. Mullis considers these experiments a success, but is unable to convince other researchers.

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11 DNA polimerases Necessitam de uma cadeia molde Incorporam nucleótidos na direcção 5-3, nunca na direcção oposta. Incorporam nucleótidos numa cadeia já existente, mas não a iniciam

12 Duplicação DNA in vivo vs. PCR Para separar as duas cadeias: Helicases e 95 ºC Topoisomerases Para iniciar a nova cadeia: Primers de RNA sintetisados por uma RNA polimerase Primers de DNA sintéticos

13 PCR 1º Ciclo (1)

14 PCR 1º Ciclo (2)

15 PCR 2º Ciclo (1)

16 PCR 2º Ciclo (2)

17 PCR 3º Ciclo (1)

18 PCR 3º Ciclo (2)

19 PCR nº de moléculas ao 20º ciclo

20 Thermus aquaticus (Taq) DNA polimerase 95 ºC 95 ºC 2 min 2 min 55 ºC 72 ºC 1 min 72 ºC 5 min 1 min 4 ºC X

21 As primeiras experiências de PCR - 3 banhos e 1 cronómetro

22 Análise dos Produtos de PCR Em regra, por electroforese em gel de agarose (validação por tamanho; falível) Por vezes, por técnicas de hibridação com sondas (dotblot, etc.) Sequenciação

23 Componentes obrigatórios para uma reacção de PCR DNA DNA polimerase Primer direito ( reverse ) Primer esquerdo ( forward ) dntps Solução tampão Mg 2+

24 O sucesso de uma reacção de PCR depende de inúmeros factores Oligonucleótidos: especificidade, tamanho, etc. Conc. de cada oliginucleótido: 0,1-0,5 mm (0,2 mm) Conc. DNA molde: depende do tipo de DNA (genómico, plasmídeo, cdna) Conc. de dntps (datp, dctp, dgtp, dttp): (200 mm) DNA polimerase: conc. (0,5 U) e tipo (Taq) Mg 2+ : 1-4 mm (2 mm) Composição do tampão e aditivos: DMSO, glicerol, detergentes

25 Notas gerais para o desenho de primers Tamanho/Especificidade Tm Sequências internas de complementaridade Conteúdo em G/C Polipirimidinas (T,C) ou polipurinas (A,G) Terminação 3

26 Tamanho/Especificidade Tamanho e especificidade de um primer estão interligados normalmente oligonucleótidos de bases são extremamente específicos e apresentam eficiência de emparelhamente óptima (desde que a temperatura de emparelhamento seja adequada)

27 Tm (melting temperature) Os Tm de ambos os primers devem ser semelhantes A relação entre Tm e temperatura de emparelhamento não é muito clara. Regra geral usa-se uma temp. de emp. cerca de 3-5 ºC abaixo do valor do Tm, mas é boa prática determinar experimentalmente T m = 2(A+T) + 4(G+C) Fórmula empírica e aproximada Válida para oligonucleótidos de bases

28 Temperatura de emparelhamento Tm representa uma estimativa da estabilidade do híbrido DNA-DNA e é crítico para a temperatura de emparelhamento (Ta) Ta muito elevada > hibridação primer-molde insuficiente > produto de PCR (amplificado) baixo Ta muito baixa > produção de amplificados inespecíficos Deve testar-se experimentalmente em incrementos de 1-2 ºC para cima e para baixo do Ta estimado Alguns termocicladores têm função de gradiente de temperatura

29 Efeito da temperatura de emparelhamento na especificidade

30 Efeito da temperatura de emparelhamento na especificidade

31 Sequências internas de complementaridade Os primers devem ser desenhados sem complementaridades internas CGGTTCTACC GCCATGTCGC E sem complementaridades entre primers (para evitar dimerização) ATGCACGGTCTAGCTGTACCGCCCGTA ATGCCCGCCATGTCGATCTGGCACGTA

32 Conteúdo em G/C e Polipirimidinas (T,C) ou polipurinas (A,G) 45% -55% G/C Sem PoliC ou PoliG Sem polipirimidinas ou polipurinas

33 Desenho de primers - sumário Idealmente um primer deve ter uma mistura aleatória das 4 bases Ter cerca de 50% em G/C Ter aproximadamente 20 bases Isto assegura normalmente um Tm de 56 ºC - 62 ºC

34 Fidelidade da Taq. Os erros são importantes? A Taq DNA polymerase não possui actividade de revisão da cadeia 3 5 (frequentemente encontrada em outras DNA polimerases) A Taq tem uma taxa de erro na ordem dos (dependendo do método de aferição). Num amplificado de 400 bp, 33% das moléculas poderão conter 1 erro (após 20 ciclos). Outras DNA polimerases com actividade de revisão da cadeia apresentam taxas de erro até 10-7 (ex: Pfu, Tgo, Pwo, etc.)

35 Programação do termociclador Tamanho do amplificado Qualidade dos primers Tipo de polimerase Tamanho do amplificado Tamanho do DNA inicial 94 ºC 94 ºC 3 min 2 min 55 ºC 1 min 72 ºC 1 min 72 ºC 5 min 4 ºC Qualidade e quantidade de DNA inicial X

36 Organização - 3 áreas de trabalho I Preparação de soluções e reagentes II Extracção de DNA das amostras e de III falsas-amostras (controlos negativos) Distribuição da Master Mix pelos tubos de PCR Adição dos extractos aos tubos de PCR Abertura dos tubos de PCR para análise electroforese e/ou dot-blot

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