Sequenciamento de Nova Geração (NGS) Msc. Frederico Schmitt Kremer // doutorando PPGB

Transcrição

1 Sequenciamento de Nova Geração (NGS) Msc. Frederico Schmitt Kremer // doutorando PPGB

2 Nos episódios anteriores...

3 Sequenciamento Clássico Engloba os métodos desenvolvidos por Sanger et al (1977) e Maxam & Gilbert (1977). Frederick Sanger Por questões de praticidade, o método de Sanger acabou se tornando o padrão ouro para sequenciamento até os anos Walter Gilbert

4 Sequenciamento Clássico Engloba os métodos desenvolvidos por Sanger et al (1977) e Maxam & Gilbert (1977). Frederick Sanger Por questões de praticidade, o método de Sanger acabou se tornando o padrão ouro para sequenciamento até os anos Walter Gilbert

5 Sequenciamento capilar

6 Vantagens do método de Sanger Alta confiabilidade. Possibilidade de leituras com até 1 Kb. Baixo custo / amostra. Ideal para estudo de genes específicos.

7 mas... Baixo throughput. Grande dificuldade para sequenciar genomas, transcriptomas e metagenomas. No máximo 96 amostras por vez.

8 Plataformas de NGS

9 Roche 454 Segunda Geração

10 454 Primeira plataforma de Next Generation Sequencing (NGS). Lançado em 2004 pela empresa Roche. Utiliza como como base o piro-sequenciamento. Leituras relativamente menores que as obtidas pelo método de Sanger (~700 bp).

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13 454: Vantagens Tamanho de leitura comparável ao obtido pelo método de Sanger. Alto throughput. Disponibilidade de vários tipos de bibliotecas (single-end, paired-end e mate-pair).

14 454: Desvantagens Problema em regiões homopoliméricas.

15 Illumina (Solexa) Segunda Geração

16 Illumina Atualmente o padrão-ouro para muitas das análises de NGS. Utiliza como como base o sequenciamento por síntese (SBS). Três linhas de equipamentos: MiSeq, NextSeq e HiSeq. Metodologia extremamente versátil e barata. Leituras de 30 bp nas primeiras versões, e agora de 120x2 em HiSeq e 250x2 em MiSeq.

17 Illumina Illumina MiSeq.

18 Illumina Illumina Lane.

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20 Illumina: Vantagens Alto throughput (principalmente nas versões HiSeq). Extremamente versátil. Grande variedade de protocolos para sequenciamento e análise de dados. Padrão da indústria.

21 Serviço de sequenciamento NGS Centros de pesquisa Empresas nacionais

22 454: Desvantagens Problema em regiões com extremo de conteúdo GC (GC%).

23 SOLiD Segunda Geração

24 SOLiD Plataforma de sequenciamento de ultra-high throughput. Baseado em hibridização e ligação. Permite o sequenciamento de genomas e transcriptomas com alta confiabilidade e cobertura (depth / coverage). Trabalha com leituras extremamente curtas (30-50 bp). Suporte à leituras mate-pair.

25 ABI SOLiD

26 Sequenciamento por ligação

27 Sequenciamento por ligação

28 Vantagens Alta cobertura. Excelente para identificação de SNPs e INDELs. Alta acurácia.

29 Desvantagem Problemático para para montagem de novo de genomas devido ao tamanho das leituras. Grande volume computacional. de dados exige grande capacidade O equipamento e reagentes são caros se comparado às tecnologias Illumina Ion Torrent.

30 Ion Torrent Segunda Geração

31 Ion Torrent Plataforma de sequenciamento atualmente distribuída pela Thermo Fisher (antiga life technologies). Baseada em sequenciamento semicondutor (por ph). Plataforma focada em velocidade e praticidade (é considerada a mais rápida para sequenciamento de genomas). Baixo custo.

32 Ion Torrent Ion Torrent PGM Ion Torrent S5

33 Sequenciamento semicondutor Ion Torrent Chip (316) Ion Torrent Chip (estrutura)

34 Sequenciamento semicondutor Ion Torrent Chip loading

35 Vantagem Equipamento e reagentes são baratos. Menos de 1 dia para se preparar o DNA e obter os dados do sequenciamento.

36 Desvantagem Problema com sequências homopoliméricas (da mesma forma que o 454).

37 PacBio Terceira Geração

38 PacBio Primeira tecnologia comercial de terceira geração. Possibilita a geração de reads com até 20 Kb. Baseada em sequenciamento de molécula individual em tempo real, e análise se cinética da polimerase.

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41 Vantagens Leituras longas facilitam o processo de montagem de genomas e transcriptomas. Análise de cinética enzimática possibilita a identificação de modificações em bases, incluindo modificações epigenética.

42 Desvantagens As primeiras versões apresentavam uma alta taxa de erro (~10% da bases). Problemas com reads quiméricas que são formadas durante o preparo do DNA. Custo elevado do equipamento e dos reagentes.

43 Oxford Nanopore Terceira Geração

44 Oxford Nanopore Sequenciamento baseado na análise do sinal elétrico gerado pela passagem de um fragmento de DNA por um poro proteico transmembrânico. Tecnologia extremamente portátil. Sequenciador descartável. Leituras > 20 Kb.

45 Oxford Nanopore

46 Oxford Nanopore

47 Oxford Nanopore

48 Vantagens Leituras longas equiparáveis às da PacBio. Equipamento barato (mas descartável) (~1000 dólares). Portabilidade permite o uso do sequenciamento de nova geração em pesquisas de campo.

49 Desvantagem Alta taxa de erros. Ainda em estágio beta. Poucos protocolos disponíveis.

50 Bibliotecas de NGS

51 Single-end Sequenciamento de apenas uma das extremidades dos fragmentos da amostra. Forma mais simples (e barata) de biblioteca. Também denominada biblioteca de fragmento.

52 Paired-end Sequenciamento de ambas as extremidades dos fragmentos da amostra. Sequências podem ser sobreponíveis ou espaçadas. Disponível para 454 e Illumina, sendo hoje o padrão de facto.

53 Paired-end

54 Mate-pair Similar ao sequenciamento paired-end, mas com um espaçamento maior entre as leituras. Mais cara, e com maior taxa de erros (false-mates). Também denominada jump library.

55 Mate-pair

56 Aplicações

57 Whole-Genome Shotgun (WGS) Democratizada pelo NGS. Sequenciamento, montagem anotação de genomas. e Genomas rascunho e finalizados. Resultou em um crescimento exponencial no número de genomas disponíveis em banco de dados públicos.

58 Whole-Genome Shotgun (WGS)

59 WGS: Pangenoma

60 RNA-Seq Sequenciamento de mrna e mirnas através do cdna. Análise pode ser de novo ou guiada por um genoma de referência. Pode ser utilizada para comparar o efeito de diferentes condições na expressão gênica.

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62 RNA-Seq: expressão diferencial

63 Análise de Variantes Identificação de regiões mutadas ou divergentes em relação à uma sequência de referência. INDELs, SNPs e CNVs são as mais analisadas.

64 Sequenciamento de Exoma

65 Metagenômica Sequenciamento do total DNA de uma amostra.

66 Single-cell sequencing

67 Dúvidas?

68 facebook: /frederico.schmittkremer

69 Obrigado! ^^