Sequenciamento de genomas: princípios e métodos clássicos

Transcrição

1 Sequenciamento de genomas: princípios e métodos clássicos Cesar Martins (cmartins@ibb.unesp.br) Departamento de Morfologia Instituto de Biociências, UNESP Universidade Estadual Paulista Botucatu, SP Sequenciamento de DNA e de genomas: Determinar a sequência de nucleotídeos ao longo da cadeia de DNA...AGCAATTGTGAGTCCCTGACTTTTTGCTTA 1

2 Aplicações Estudo de genes Diagnóstico forense e clínico Identificação de indivíduos Estudos comparativos Evolução, Fisiologia, Ecologia,... Conhecimento do genoma Genomas sequenciados Primeiro genoma sequenciado: Fago X174, pb (9 genes) Sanger et al. 1977, Nature 265: Primeiro eucarionte sequenciado: Saccharomyces cerevisae, 13 milhões pb Goffeau et al. 1996, Science 274: 546, Primeiro animal sequenciado: Caenorhabditis elegans, 100 milhões pb C elegans Sequencing Consortium 1998, Science 282: Primeira planta sequenciada: Arabidopsis thaliana, 157 milhões pb Arabidopsis Genome Initiative 2000, Nature 408: Genoma humano: 3 bilhões pb International Human Genome Sequencing Consortium 2001, Nature: 409: ; Venter et al. 2001, Science 291:

3 Genomas sequenciados 359 species More than 1000 genomes available Source: NCBI, July 13/2014 Princípios e Métodos Clássicos Método químico Maxam & Gilbert 1977 Método dideoxi ou de terminalização Sanger et al

4 Método químico Método químico Walter Gilbert Prêmio Nobel em Bioquímica (1980) 4

5 Arranjo dos nucleotídeos na molécula de ácido nucléico fosfato Base Nucleotídeo açúcar Ligação fosfodiéster Nucleotídeo Ligação fosfodiéster Nucleotídeo Arranjo dos nucleotídeos na molécula de ácido nucléico 5

6 Clivagem preferencial do DNA em nucleotídeos específicos Clivagem preferencial do DNA em nucleotídeos específicos Dimetilfulfato Piperidina 6

7 Marcar os finais da dupla fita de DNA com 32 P Desnaturar o DNA para separar as fitas Desnaturação 7

8 Método químico Método químico 8

9 Método químico Método químico A>G G>A C C+T eletroforese 9

10 d Método químico..._c..ss A'G G)A C C+T - -. A_... A' - O,,, A FAST STRAND SLOW STRAND AIG GA C G A GT C+T.- -w w Ehc-- T..cF.T., A...: ;:: A-..T:-:.- T 3, C Ai C #Zal Método químico A>G G'A C C+T -m T G AC -I-!" --- G G C C G A A A G C A C A C C *---G hn0g C A 10

11 Método dideoxi ou de terminalização Método dideoxi ou de terminalização Frederick Sanger Dois prêmios Nobel em Bioquímica *Método dideoxi de sequenciamento *Sequenciamento Shotgun Sanger Institute, Cambridge, England 11

12 Arranjo dos nucleotídeos na molécula de ácido nucléico fosfato base Nucleotídeo açúcar Ligação fosfodiéster Nucleotídeo Ligação fosfodiéster Nucleotídeo Duplicação do DNA Fita contínua Fita descontínua Primers 12

13 Duplicação do DNA DNA polimerase requer extremidade 3 OH para adicionar próximo nucleotídeo Método dideoxi ou de terminalização Nucleotídeo normal Deoxinucleotídeo Nucleotídeo sem grupo OH no carbono 3 do açucar Dideoxinucleotídeo 13

14 Método dideoxi ou de terminalização T G C A Deoxinucleotídeos normais T G C A Dideoxinucleotídeos (nucleotídeos alterados) Método dideoxi ou de terminalização ** IMPORTANTE!! primer ou um dos nucleotídeos marcados radioativamente! 14

15 Método dideoxi ou de terminalização Seqüenciamento manual Método dideoxi ou de terminalização Seqüenciamento manual by C Martins (1999) 15

16 Gilbert X Sanger Gilbert Requer grande quantidade de DNA purificado e muitos passos de purificação; Digestões enzimáticas; Produz curtas leituras; Encontrou aplicação em footprinting ; Não requer clonagem; Automatização não disponível. Sanger Requer clonagem do fragmento de interesse; Requer muito pouco DNA; Não necessita de digestões; Desenvolvimento de automação. Método dideoxi ou de terminalização Desenvolvimento de sequenciamento automatizado 1986: Leroy E. Hood's laboratory at the California Institute of Technology announce the first semi-automated DNA sequencing machine. 1987: Applied Biosystems markets first automated sequencing machine, the model ABI

17 Seqüenciamento automático versão I A AGCTTA AGCTTACGA AGCTTACGAA AGCTTACGAATGCGTCCA AGCTTACGAATGCGTCCACA AGCTTACGAATGCGTCCACAA AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTA AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACA AG AGCTTACG AGCTTACGAATG AGCTTACGAATGCG AGCTTACGAATGCGTCCACAACG AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACAG AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACAGG AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACAGGTG! AGC AGCTTAC AGCTTACGAATGC AGCTTACGAATGCGTC AGCTTACGAATGCGTCC AGCTTACGAATGCGTCCAC AGCTTACGAATGCGTCCACAAC AGCTTACGAATGCGTCCACAACGC AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTAC AGCT AGCTT AGCTTACGAAT AGCTTACGAATGCGT AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCT AGCTTACGAATGCGTCCACAACGCTACAGGT A G C T T G C A A G C T T G C A Seqüenciamento automático versão II Nature 321, (12 June 1986); doi: /321674a0 Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis LLOYD M. SMITH, JANE Z. SANDERS, ROBERT J. KAISER, PETER HUGHES, CHRIS DODD, CHARLES R. CONNELL *, CHERYL HEINER *, STEPHEN B. H. KENT & LEROY E. HOOD A different coloured fluorophore is used for each of the reactions specific for the bases A, C, G and T. The reaction mixtures are combined and co-electrophoresed down a single polyacrylamide gel tube.. Leroy Hood 17

18 Seqüenciamento automático versão II DNA Primer Nucleotídeos normais (A, C, G, T) Dideoxinucleotídeo DNA polimerase tampão A C G T T G C A A C G T : dideoxi nucleotídeos marcados com compostos fluorescentes Seqüenciamento automático versão II 18

19 Seqüenciamento automático versão II Seqüenciamento automático versão II 19

20 Seqüenciamento automático versão II Cromatograma Seqüenciamento automático versão II 20

21 Seqüenciamento automático versão III (capilar) Seqüenciamento automático versão III (capilar) 21

22 Seqüenciamento automático versão III (capilar) 22

23 Seqüenciamento automático versão III (capilar) Seq capilar por Sanger Animations/DNA/WTDV htm Seqüenciamento automático Plasmidio AMOSTRAS PARA SEQUENCIAMENTO PCR 23

24 Seqüenciamento automático Plasmidio AMOSTRAS PARA SEQUENCIAMENTO Sequenciamento de genomas inteiros 24

25 Sequenciamento total de genomas Hierarchical shotgun sequencing Whole genome shotgun sequencing Desvendando a complexidade dos genomas Mapa físico da seqüência nucleotídica HGP Celera 25

26 Sequenciamento clássico por Sanger : Sequenciamento de primeira geração -Vantagens -Limitações Sequenciamento de próxima geração: segunda, terceira, quarta geraçao 26

27 Curso de Férias Análise genômica de Julho de 2014 Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP 27