09/07/2014. Sequenciamento de nucleotídeos. Sequenciadores. Sequenciamento com terminadores (Sanger) Sequenciamento com terminadores (Sanger)
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- Simone Philippi Barateiro
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1 Sequenciamento com terminadores (Sanger) Sequenciamento de nucleotídeos Fábio Gregori Sequenciadores de placa Sequenciamento com terminadores (Sanger) Sequenciadores de capilar Sequenciamento com terminadores (Sanger) Sequenciadores Sequenciadores de capilar 1
2 Reação de sequenciamento Cátion divalente (Mg 2+ ) Dideoxinucleosídeos trifosfato marcados (ddntps) Deoxinucleosídeos trifosfato (dntps) Terminadores Tampão para manter o ph MIX DNA polimerase termoestável Amostra de DNA amplificado (APENAS UM) Primer Terminadores Purificação do DNA Quantificação de DNA Reação 2
3 Reação Reação Remoção de terminadores Propanol / isopropanol A G N T G T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G C G A A T T C G A G C T C G G T A C C C G G G G A T C C T C T A G A G T C G A C C T G C A G G C A T G C A A G C T T G A G T A T T C T A T A G T G T C A C C T A A A T A G C T T G G C G T A A T C A T T G G T C A T A G C T G T T T C C T G T G T G A A A T T G T T A T C C G C T C A C A A T T C C A C A C A A C A T A C G A G C C G G A A G C A T A A A G T G T A A A G C C T G G G G T G C C T A A T G A G T G A G C T A A C T C A C A T T A A T T T G C G T T G C G C T C A C T G C C C G C T T T C C A G T C G G G A A A C C T G T C G T G C C A G C T G C A T T A A T G A A T C G G C C A A C G C G C G G G G A G A G G C G G T T T G C G T A T T G G G C G C T C T T C C G C T T C C T C G C T C A A C T G A C T C G C T G C G C T C G G T C G T T C G G C T G C G G C G A G C G G T A T C A G C T C A C T C A A A G G C G G T A A T A C G G T T A T C C A C A G A A T C A G G G G A T A A C G C A G G A A A G A A C A T G T G A G C A A A A G G C C A G C A A A A A G G C C A G G A A C C G T A A A A A G G C C G C G T T G C T G G C G T T T T T C C A T A G G C T C C G C C C C C C T G A C G A G C A T C A C A A A A A T C G A C G C T C A A G T C A G A G G T G G C G A A A C C C G A C A G G A C T A T A A A G A T A Reverso+complemento 3
4 5 T A G C G T T C G A T C G A T G C G G C A T 3 PRIMER ANTISENSO 5 T A G C G T T C G A T C G A T G C G G C A T 3 PRIMER ANTISENSO 5 T A C G G C G T A G C T A G C T T G C G A T 3 PRIMER AS REVERSO 5 T A G C G T T C G A T C G A T G C G G C A T 3 PRIMER ANTISENSO 5 T A C G G C G T A G C T A G C T T G C G A T 3 PRIMER AS REVERSO 5 A T G C C G C A T C G A T C G A A C G C T A 3 PRIMER AS RV+ COMP Softwares - cromatogramas Finch TV Applied Sequence Scanner Etc, etc
5 Outras metodologias Pirosequenciamento Geração de luz (luminescência) a cada inserção de base. Leitura de 250 / 400 bp Mix: ssdna molde Primer Sulfurilase Luciferase Adenosina 5 fosfosulfato (APS) Luciferina Adição sequencial de cada dntp Apirase Pirosequenciamento Pirosequenciamento Adenosina 5 fosfosulfato 5
6 Equipamentos Equipamentos Ion Torrent Na natureza, quando um nucleotídeo é incorporado numa fita de DNA pela polimerase, um íon de hidrogênio é liberado com sub-produto. Ion torrent De 1 a 7 milhões de detectores/chip Ion torrent 6
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