Pergunta 1. A fim de ser localizado na membrana plasmática, o SF-R deve primeiro passar por várias etapas dentro da célula.

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1 Pergunta 1 Parte A Você está estudando um receptor chamado Receptor do Fator de Tamanho ou SF-R em um eucariota haplóide. Abaixo encontra-se um diagrama esquemático da proteína SF-R: A fim de ser localizado na membrana plasmática, o SF-R deve primeiro passar por várias etapas dentro da célula. a) Desenhe uma configuração do SF-R na forma como ele iria aparecer na vesícula de transporte (após deixar o RER) e na membrana plasmática abaixo. Não se esqueça de rotular os domínios apropriados e as terminações N e C da proteína. 8 PONTOS b) A Partícula de Reconhecimento de Sinal (SRP) direciona o peptídeo nascente SF-R para... (circule uma). Complexo de Golgi Retículo Endoplasmático Núcleo Lisossoma 2 PONTOS 1

2 Nome Pergunta 1 (cont.) Parte B O SF-R foi identificado como um receptor da tirosina-quinase. Quando o ligando SF se liga a SF-R, uma cascata de transdução de sinal é ativada. A sinalização através de SF-R leva a uma expressão de proteínas necessária para um tamanho normal de célula. Se a sinalização através de SF-R sofre ruptura, o tamanho da célula é menor. Para estudar os domínios da proteína SF-R com mais detalhes, você isola três mutantes SF-R. Você cultiva cada um dos mutantes na presença de SF e mede duas propriedades: a localização SF-R e o tamanho da célula. c) Indique onde cada uma das mutações em SF-R, [(S), (L), (T), (K), descritas abaixo], seria consistente com os fenótipos observados relacionados para os mutantes no gráfico a seguir. 12 PONTOS (S) deleção de domínio de seqüência de sinal apenas (L) deleção de domínio de ligação a ligando apenas (T) deleção de domínio transmembrana apenas (K) deleção de domínio quinase apenas Fenótipos Linhagem Localização SF-R Tamanho da Célula Mutação(ões) Possível(is) Tipo Selvagem membrana plasmática normal nenhuma Mutante 1 membrana plasmática pequeno L, K Mutante 2 citoplasma pequeno S Mutante 3 fora da célula / secretado pequeno T 2

3 Pergunta 1, Parte B (cont.) A figura a seguir representa a cascata de sinalização na célula que leva à expressão de genes que determinam o tamanho da célula. d) Se você acidionar uma forma de SF que se liga irreversivelmente a SF-R a células de tipo selvagem, que efeito isso terá na trajetória de sinalização abaixo do SF-R? (Circule uma das seguintes alternativas). 3 PONTOS Nenhum Efeito Sempre Ativa Sempre Inativa e) Você isola DNA de outra linhagem mutante e determina a seqüência de seu gene SF-R. Você descobre que há mutações que mudam os dois aminoácidos tirosina (Y) no domínio plasmático para alanina (você pode assumir que essas mutações não afetam a dobra ou a localização do SF-R). Que efeito isso terá na trajetória de sinalização abaixo do SF-R? Nenhum Efeito Sempre Ativa Sempre Inativa 3

4 Pergunta 2 Nome Interessado em descobrir por que os Red Sox apresentam uma performance tão insatisfatória, você analisa amostras de sangue de jogadores atuais do Red Sox. Você descobre uma proteína única, à qual dá o nome de YysSk, encontrada apenas nos jogadores do Red Sox, que pode explicar sua performance decepcionante. A caracterização completa dessa proteína iria exigir a retirada de litros de sangue dos jogadores (o que dificilmente iria melhorar sua performance), então você decide expressar a proteína YysSk nas bactérias. Você faz a triagem de uma biblioteca de cdna e identifica um clone positivo ao qual dá o nome de pys. Você conhece a seqüência do plasmídeo de DNA adjacente ao inserto de cdna (mostrado abaixo). A fim de determinar a seqüência desse inserto, você usa os seguintes primers. Primer 1: 5 TCAGTC 3 Primer 2: 5 CGGCGC 3 a) Qual dos seguintes itens seria uma seqüência válida para o filamento superior de seu inserto de cdna, conforme determinado nos géis seqüenciadores acima? Circule um. 4 PONTOS 4

5 Pergunta 2 (cont.) Agora, você deseja expressar essa proteína em bactérias. O clone cdna, pys, que você isolou é apresentado abaixo. Esse plasmídeo atua como um promotor bacteriano, então você planeja clonar o gene YysSk em puc19, que possui um promotor bacteriano em si (ver abaixo). Você digere pys e puc19 com Bg1II, executa as reações em gel de agarose juntamente com os plasmídeos não-digeridos (não-cortados). Depois de fazer a coloração para DNA, você vê a imagem abaixo. b) Quais fragmentos você purificaria para misturar para ligação? Circule os fragmentos corretos no gel acima. 4 PONTOS c) Você transforma células com sua mistura de ligação. O que você deve acrescentar ao meio em placa de Petri para isolar somente bactérias que tomaram um plasmídeo? 3 PONTOS AMPICILINA 5

6 Pergunta 2 (cont.) Nome Você pega três colônias (X, Y e Z), isola o DNA de seu plasmídeo e realiza uma análise de restrição. O gel tingido é apresentado abaixo. d) Indique o plasmídeo contido em cada colônia. Escolha entre os plasmídeos mostrados ao fim desta página (p1, p2 ou p3). 5 PONTOS Colônia X contém Colônia Y contém Colônia Z contém p1 p3 p2 e) Qual dos plasmídeos abaixo você conseguiu encontrar por clonagem por hibridização usando o DNA YksSk como sonda? 2 PONTOS p1 e p3 f) Qual plasmídeo você usaria para purificar a proteína YksSk? p3 3 PONTOS 6

7 Pergunta 2 (cont.) Para fins de purificação de proteína, você gostaria de adicionar quatro histidinas à terminação N de YksSk, já que essas histidinas se ligam fortemente ao níquel, permitindo a você separar YksSk de proteínas bacterianas. g) Dadas as seguintes terminações de código no gene YksSk, quais dois primers PCR você escolheria para amplificar o gene YksSk e adicionar quatro histidinas na terminação N de YksSk? (Obs.: O códon para histidina é CAU). Gene YksSk 5 ATG CGG ATA CGT.. CGG CTT CCC TAA 3 3 TAC GCC TAT GCA.. GCC GAA GGG ATT 5 6 PONTOS Circule um primer de cada coluna para amplificação PCR. h) Você escolhe seus primers e os adiciona a seu tubo PCR, assim como um modelo de DNA YksSk e polimerase Taq. Você programa sua máquina de PCR para realizar 30 seqüências de amplificação. Após executar sua reação em gel de agarose e tingir o gel para DNA, você vê... nada! Seu parceiro de laboratório, que viu você fazer tudo isso, dá uma risadinha e aponta seu grande erro. Qual foi ele? 3 pontos Você se esqueceu de adicionar nucleotídeos. 7

8 Pergunta 3 Nome O gene lacz codifica a enzima β-galactosidase, que metaboliza a lactose em E. coli. O óperon lac em E. coli é transcricionalmente regulado pela proteína repressora Lac I, cuja ação é inibida pela ligação da lactose. A região cromossômica do óperon é mostrada abaixo. P I laci P IAC O lacz é o promotor para o gene laci codifica a proteína repressora é a seqüência promotora para lacz é a seqüência operadora codifica β-galactosidase, a enzima que quebra a lactose Os mutantes a seguir são feitos e examinados por seus níveis de β-galactosidase na presença e ausência de lactose. + significa tipo selvagem - - significa uma mutação que reduz a função O C significa um operador que confere expressão constitutiva de lacz a) Indique o nível de β-galactosidase para cada genótipo, usando os termos ALTO ou BAIXO. 6 PONTOS genótipo - lactose + lactose I + + P lac O + Z + baixo alto I - + P lac O + Z + alto alto I + P + lac O c Z + alto alto I + P - lac O + Z + baixo baixo b) Preencha a tabela para os seguintes diplóides baterianos. 8 pontos Plasmídeo F Cromossomo - lactose + lactose 1. I + P lac+ O + Z + I + P lac+ O + Z + 2. I + P lac+ O + Z + I + P lac+ O + Z + 3. I + P lac+ O + Z + I + P lac+ O + Z + 4. I + P lac+ O + Z + I + P lac+ O + Z + 5. I + P lac+ O + Z + I + P lac+ O + Z + c) Circule os componentes na lista abaixo que atuam APENAS em cis. laci P lac O lacz 8

9 Pergunta 4 O gráfico a seguir ilustra uma ação potencial medida em um único ponto ao longo de um axônio. Quatro pontos são realçados ao longo da curva,,,,. a) Na tabela abaixo, identifique qual íon (Na +, K +, Ca ++, Cl - ) está passando pelo maior fluxo líquido através da membrana nos pontos indicados e afirme a direção em que o íon está se movendo (para o interior ou exterior da célula). 6 pontos Ponto Íon Direção (dentro/fora) Na + dentro K + fora b) O potencial de membrana é de 70 mv nos pontos e no gráfico acima. Qual dos canais iônicos ativados por voltagem é fechado no ponto, mas aberto no ponto? 3 pontos canal k + ativado por voltagem c) O que determina o fechamento do canal ativado por voltagem que é aberto no ponto? 3 pontos TEMPO d) Há pelo menos três estados em que existem canais Na + dependentes de voltagem. No ponto do gráfico acima, a maioria dos canais Na + dependentes de voltagem estaria em que estado? Circule a melhor resposta. 3 pontos Aberto Fechado Inativado 9

10 Pergunta 4 (cont.) Nome Dois neurônios pré-sinápticos diferentes, neurônio 1 e neurônio 2, fazem sinapse para a célula W, conforme mostrado abaixo. Quando o neurônio 1 é estimulado, a membrana da célula W é localmente despolarizada. Quando o neurônio 2 é estimulado, a membrana da célula W é localmente despolarizada exatamente na mesma extensão que a observada com o neurônio 1. e) Circule a única afirmação verdadeira abaixo. 3 pontos Se a estimulação é igual, o neurônio 1 apresenta mais probabilidade de resultar em uma ação potencial na célula W que o neurônio 2. Se a estimulação é igual, o neurônio 2 apresenta mais probabilidade de resultar em uma ação potencial na célula W que o neurônio 1. Se a estimulação é igual, o neurônio 1 e o neurônio 2 apresentam a mesma probabilidade de resultar em uma ação potencial na célula W. f) Se você fosse exposto a uma toxina que bloqueasse de forma irreversível os canais de Ca ++ ativados por voltagem, indique se as afirmações a seguir seriam VERDADEIRAS ou FALSAS. 6 pontos V F A sinapsina amarra as vesículas secretórias. V F Seus músculos terminam em uma contração rígida. V F As vesículas secretórias preenchidas com neurotransmissores iriam se fundir com a membrana plasmática. 10

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