UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ-UECE

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ-UECE LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA HUMANA Maria Izabel Florindo Guedes Grupo de Pesquisa: Grupo de Inovação Biotecnológica em Saúde

2 Maria Izabel Florindo Guedes Desenvolvimento de vacina contra a Dengue em Tecnologia Vegetal

3 Por que a Dengue? Estima-se que 50 a 100 milhões de casos Brasil é líder absoluto de casos de dengue da América Latina (~60% do total) Ceará casos em 2013.

4 Vacinas contra Dengue O As primeiras iniciativas de produzir vacinas contra o dengue surgiram há mais de 50 anos. O Desde a década de 70, a OMS tem incentivado o desenvolvimento de estudos na produção de vacinas contra o dengue.

5 Obstáculos que desafiam os pesquisadores O Necessidade de uma vacina tetravalente com proteção duradoura. O Resposta imune e patogenia. O Possibilidade de mutações dos vírus selvagens. O Riscos de mutações de vírus vacinais e infecção dos vetores por vírus vacinais. O Falta de um modelo animal para testar a efetividade da vacina.

6 Estratégias para superar os obstáculos? Produção em plantas O Plantas transgênicas O Cultura de célula vegetal O Cloroplastos O Produção transiente

7 Vantagens O Ausência de risco de contaminação com patógenos que infectam o homem e outros animais. O Baixo custo de produção. O Possível produção em grande escala. O Célula eucariótica (modificações póstradução corretas).

8 Arbovírus (Arthropode Borne Virus) Família: Flaviviridae Gênero: Flavivirus v Genoma: + SS com RNA (11 kb) Virion envelopado Icosaédrico (40 a 50 nm) C Virus complexo (1-4 sorotipos) E M RNAss

9

10 ETAPAS: NA PRODUÇÃO DE VACINAS 1-Alinhamento dos quatro sorotipos do Vírus do Dengue 2-Escolha da região da proteína E mais imunogênica 3-Confecção dos oligonucleotídeos 4-PCR 5-purificação dos fragmentos multiplicados 6-Inserção dos fragmentos no cdna do Vírus de planta (vetor) 7-Sequenciamento 8-Inoculação em plantas 9-Purificação das proteínas do vírus do dengue 10-Imunizaçaõ de camundongos

11 Alinhamento do EDIII do vírus dengue (em destaque os resíduos de cisteína)

12 Vetor baseado no Vírus do Mosaico do caupi (CPMV) PNC-1 + PNC-2 INFECÇÃO Poli-proteína viral Peptídeo de clivagem (liberação de proteína exógena) Vírus de planta Gene X Gene Y Gene Z Terminador bp ApaI StuI

13 Domínio III (EDIII) Proteína E Vírus Dengue Proteína E Plasmídeo binário baseado em vírus vegetal

14 Alinhamento do EDIII do vírus dengue (em destaque os resíduos de cisteína) EDIII-1 EDIII-2 EDIII-3 Quim P S P S P S P S * 41 kda 15 kda Expressão de proteína quimérica em modelo procarionte Westernblot com anticorpo monoclonal anti-his

15 Foto mostrando a inoculação de plantas de Vigna unguiculata, com o plasmídeo CPMV contendo o inserto 2/9 da proteína E do (DEN-2).

16 Planta de Vigna unguiculata L. (feijão-de-corda) infectada com o inserto (DEN-2 ), 10 dias após a inoculação. A planta apresenta os sintomas característicos do vírus CPMV.

17 Planta de Vigna unguiculata L. (feijão-de-corda) mecanicamente inoculadas com extrato de plantas infectadas com o inserto Isaac (DEN-1 inserido no Pbin-3), 20 dias após a inoculução do plasmídeo.

18

19 Sistema de produção de antígeno quimérico contendo o Domínio III da proteína E dos diferentes sorotipos de vírus dengue. Domínio III (EDIII) Proteína E Vírus Dengue Proteína E Plasmídeo receptor (adição de His-Tag) EDIII Den-1 EDIII Den-2 EDIII Den-3 EDIII Den-4 Proteína quimérica F R Primers de transporte Expressão procarionte Expressão em plantas Vacina de DNA

20 Alinhamento do EDIII do vírus dengue (em destaque os resíduos de cisteína) EDIII-1 EDIII-2 EDIII-3 Quim P S P S P S P S * 41 kda 15 kda Expressão de proteína quimérica em modelo procarionte Westernblot com anticorpo monoclonal anti-his

21 Purificação das Proteínas Recombinantes Eletroforese SDS-PAGE com proteína E do vírus dengue produzidas em Planta de Vigna unguiculata L. (feijão-de-corda):1-marcador de PM, 2-DENcérebro de camundongo, 3-Planta sadia e 4 a 10 proteína E recombinante produzida em feijão-de-corda.

22 M FIGURA-4:Eletroforese SDS PAGE em gel 12%. M- Marcador de peso molecular, 1- extrato da planta infectada com PNC 3+ inserto Dengue, 2- Planta sadia e 3- Extrato de planta infectada com PNC- RNA-2 contendo o inserto Dengue. Western blotting, com anticorpos anti-dengue comercial: 1 e 3- Extrato de plantas infectadas com PNC- RNA-2 contendo o inserto dengue, 2-Extrato Planta sadia.

23 A B Western blotting- A: com anticorpo monoclonal anti-histidina comercial e B: anticorpos policlonais anti-dengue contra proteína E do vírus dengue produzidas em Planta de Vigna unguiculata L. (feijãode-corda)

24 Resposta imunológica induzida pelas proteínas purificadas das plantas -Os anticorpos produzidos pelas vias subcutânea e Oral reconheceram especificamente os quatro sorotipos (vírus purificado).

25 FIGURA-6: Teste Enzyme linked immunossorbent assay (ELISA) com anticorpos policlonais anti-dengue, mostrando reações específicas contra diferentes peptídeos produzidos em plantas de Vígna unguiculata L. : A-Fragmento da Proteína E DEN-2, B- Fragmento da Proteína E DEN-1; C- Vírus dengue purificado do cérebro de camundongo (controle +); D- Extrato planta infectada com vetor baseado no vírus CPMV sem o inserto; E-Extrato de planta de V. unguiculata Sadia (não infectada). As letras (a-d) significam diferença significativa (P< 0,05 de acordo com teste de Tukey).

26 Vantagens para a população 1-Representa o controle de uma doença que mata milhares de pessoas por ano. 2-Utiliza método que não agride o meio ambiente. 3-Via de imunização não invasiva. 4-Baixo custo.

27 Abre perspectiva para a produção de vacinas comestíveis!!!

28 Empresa de produtos biotecnológicos, desenvolvidos em plataformas vegetais. A Greenbean produz proteínas recombinantes para o desenvolvimento de kits de diagnósticos, fármacos, vacinas, bem como desenvolve alimentos funcionais para atender os mercados humano e animal.

29 Fundada por um grupo de pesquisadores multidisciplinares da Universidade Estadual do Ceará (Uece), a Greenbean encontra-se registrada e incubada na incubadora de empresas da universidade, atuando nas áreas de biotecnologia, imunologia, microbiologia, bioquímica e biologia molecular.

30 Proteína E (quatro sorotipos do vírus do dengue) Proteína NS1 ( quatro sorotipos do vírus do dengue) Proteína do vírus da Hepatite C Proteína P28 do CAEV (Encefalite caprina) Interferon alfa Proteínas sob encomenda

31 CNPq e CAPES

32 OBRIGADA!!!

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