Ao meu orientador, Ieso de Miranda Castro, pela oportunidade de trabalho, investimento e todo auxílio prestado.

Transcrição

1 Ao meu orientador, Ieso de Miranda Castro, pela oportunidade de trabalho, investimento e todo auxílio prestado. Ao meu co-orientador e chefinho do coração, Evanguedes Kalapothakis, com quem trabalho desde o 5º período da graduação, há mais de cinco anos, e com quem aprendi tudo o que sei praticamente de trabalho de bancada, cotações, preparação de artigos científicos, projetos, cursos e - principalmente - como me comportar profissionalmente perante jornalistas e fotógrafos do EM! Muito obrigada por tudo, chefe! Ao pessoal do Laboratório de Bioquímica e Fisiologia de Microorganismos da UFOP, Ana Maria, André, Liz, Luciano, Michele, Totola e Zézé, por toda a ajuda, ânimo, bom humor e hospitalidade. Ao pessoal do Laboratório de Biotecnologia e Marcadores Moleculares do ICB-UFMG: - Alessandra, Ana Carolina Campi, Fabíola, Ju, Marluce e Valéria, pelo companheirismo, pelas brincadeiras, pelas dicas e quebra-galhos. - Às minhas amigonas, Carolina Campolina, Flávia, Simone e Thaís, por tantos anos de boa convivência, por tudo o que passamos juntas, por serem do jeito que são e terem me ensinado, cada uma de sua maneira, coisas tão especiais. Vão ficar saudades, meninas! - Ao Lorde do nosso laboratório: Gabriel. Sempre prestativo, gentil e com questionamentos muito inteligentes... O único companheiro da ala masculina do nosso chefe por um bom tempo. - E também à nova geração do lab, Ana Luíza, Arthur, Flavinha, Kika e, em especial, ao Higgor, que têm me ajudado muito nesta etapa final da tese. Boa sorte para vocês! Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da UFOP e, em especial, aos Professores Rogélio Lopes Brandão e Elio Hideo Babá. Ao Professor Carlos Chavéz-Olórtegui e todos os seus alunos. Ao CNPq pelo apoio financeiro. E por fim, aos casais: Natasha e Cláudio e Cláudia e Rodrigo, que sempre me receberam com os braços abertos em suas casas em Porto Alegre, me emprestaram o computador umas mil vezes para eu escrever e imprimir a tese e que, sem dúvida, farão às vezes da minha família nesta minha nova cidade. Muito obrigada!

2 "Só sei que nada sei". SÓCRATES

3 Neste trabalho, objetivando a caracterização molecular de transcritos da glândula de veneno da aranha-marrom Loxosceles intermedia para a ampliação do banco de dados de toxinas, 268 seqüências foram agrupadas em 136 singlets e 33 consensos. Estas seqüências foram submetidas à anotação gênica para que fossem identificadas por meio de buscas de similaridade contra diferentes bancos de dados. Em seguida, foram classificadas em categorias funcionais, analisadas quanto a sua função biológica e, quando possível, modeladas por homologia para que verificássemos sua provável estrutura tridimensional. Além disso, a fim de produzir bioinseticidas de alta eficiência e especificidade, trabalhamos com toxinas de atividade letal para insetos de importância agrícola. Recentemente, a partir da purificação do veneno bruto de L. intermedia e da construção de uma biblioteca de cdna das glândulas de veneno desta aranha, nosso grupo caracterizou toxinas com forte ação inseticida em larvas de Spodoptera frugiperda, a lagarta-do-cartucho do milho. Devido às dificuldades para se obter do veneno bruto as toxinas identificadas por biologia molecular, o uso de sistemas de expressão heterólogos torna-se necessário tanto para o estudo dos genes isolados dessas toxinas quanto para a sua obtenção em grandes quantidades. Um dos sistemas heterólogos de controle a pragas mais estudados em nível nacional e internacional é aquele que utiliza no combate a diversas pragas agrícolas. O sistema supera em vários aspectos os sistemas tradicionais de inseticidas químicos, sendo considerado por diversos autores como seguro ao meio ambiente e ao homem e, também, apresentando potencialmente um custo final por hectare menor do que o dos inseticidas químicos. Assim, realizamos - através da subclonagem em vetores de transferência do sistema de expressão - a inserção dos genes das toxinas inseticidas LiTx1, LiTx2 e LiD1 (previamente identificadas a partir da glândula de veneno de L. intermedia) ao genoma do AcMNPV. O sucesso da construção dos vírus recombinantes foi verificado após infecção de células de inseto e também por PCR. A expressão das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 foi verificada por RT-PCR, SDS-PAGE e Western Blotting. Bioensaios com os vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em larvas de S. frugiperda demonstraram sua eficácia inseticida, com diminuição do tempo de vida desta lagarta, quando comparada aos vírus selvagens. Acreditamos que os recombinantes aqui gerados poderão permitir a expressão em larga escala das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiD1 de L. intermedia. Isso possibilitará a realização de estudos de caracterização dessas toxinas inseticidas quanto aos seus mecanismos de ação e permitirá também sua utilização como ferramentas na pesquisa básica para estudos de canais iônicos e outros processos fisiológicos.

4 In order to get an overview of all Loxosceles intermedia venom gland transcripts, we performed a clustering analysis of 268 cdna sequences available in our laboratory. The 136 singlets and 33 consensus sequences generated after alignment, allowed the identification by database searches of several distinct genes/proteins in the gland. We analyzed these sequences, classified them in functional categories (biological function) and, whenever possible, predicted their 3D structure by homology. Moreover, aiming the production of highly efficient bioinsecticides, our group has worked with insecticidal toxins. Recently, we located and characterized, by chromatography of L. intermedia crude venom and screening of its venom gland cdna library, lethal toxins to Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae): a plague which attacks the Brazilian corn culture since harvesting to storage. Due to practical limitations to get from the crude venom a high rate of previously identified neurotoxins, the use of expression systems to study heterologous genes becomes necessary. Baculovirus is one of the most studied heterologous systems used worldwide as a resource for combating pests. They are powerful, versatile and provide advantages concerning finance, ecology and human health. In this manner, we subcloned genes of the insecticidal toxins LiTx1, LiTx2 and LiD1 (previously identified from L. intermedia venom gland) in baculovirus expression vectors. The construction s success of the recombinant virus was verified after insects cells infection and also by PCR. The expression of LiTx1, LiTx2 and LiD1 toxins was verified by RT-PCR, SDS- PAGE and Western Blotting. Bioassays with the recombinant virus LiTx1 and LiTx2 in S. frugiperda larvae showed their insecticidal efficacy, with life-time reduction of this plague when compared to the wild virus. We believe recombinant baculovirus herein generated will allow a large scale expression of L. intermedia toxins LiTx1, LiTx2 and LiD1. This will conduce to characterization studies of the action mechanisms of these toxins and also will permit their use as tools to basic researches in ionic channels and physiologic processes.

5 PÁGINA 1. INTRODUÇÃO Análises bioinformáticas Inseticidas químicos x Bioinseticidas As aranhas Comentários gerais Composição geral do veneno Toxinas inseticidas Aranhas do gênero Loxosceles Comentários gerais Composição geral do veneno Toxinas inseticidas Os Expressão de toxinas em sistema OBJETIVOS Geral Específicos JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA MATERIAIS Equipamentos Programas Reagentes Antibióticos Meios de cultura Soluções Tampões Outros 35

6 PÁGINA 4.4. Linhagens celulares Genótipo das linhagens bacterianas hospedeiras MÉTODOS Análises bioinformáticas de transcritos da glândula de veneno de Loxosceles intermedia Obtenção das seqüências Tratamento das seqüências Agrupamento das seqüências Anotação dos uniques Classificação manual dos uniques em categorias funcionais Análises biológicas dos uniques classificados em categorias funcionais Modelagem molecular dos uniques Veneno bruto de L. intermedia Atividade inseticida do veneno bruto de L. intermedia Análise de similaridade das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3 de L. intermedia 5.5 Subclonagem do DNA das toxinas LiTx1 e LiTx2 de L. intermedia no vetor de transferência psynxiv VI + X3 do sistema de expressão PCR para amplificação do DNA da região madura de LiTx1 e LiTx Purificação do produto de PCR Clonagem do produto de PCR de LiTx1 e LiTx2 no vetor de clonagem pcr 2.1-TOPO Transformação de bactérias por eletroporação PCR de colônias Extração em baixa escala de plasmídeos (mini-prep) Digestão do vetor pcr 2.1-TOPO contendo a região madura de LiTx1 ou LiTx2 com EcoR I Seqüenciamento automático capilar

7 PÁGINA Purificação dos fragmentos da região madura de LiTx1 e LiTx2 57 obtidos pela digestão do vetor pcr 2.1-TOPO com EcoR I Digestão do vetor psynxiv VI + X3 do sistema de expressão 57 com EcoR I Ligação do fragmento da região madura de LiTx1 ou LiTx2 no 59 vetor psynxiv VI + X Precipitação do produto de ligação Transformação de bactérias por eletroporação PCR de colônias Extração em baixa escala de plasmídeos (mini-prep) Seqüenciamento automático capilar Produção de vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em sistema Co-transfecção Verificação por PCR da presença dos vírus recombinantes 64 vsynlitx1 e vsynlitx2 em culturas celulares Verificação por RT-PCR da presença de RNAs mensageiros dos 67 vírus recombinantes vsynlitx1 e vsynlitx2 em culturas celulares Análise da expressão das partículas virais recombinantes por 69 SDS-PAGE Análise da expressão das partículas virais recombinantes por 70 Western Blotting 5.7 Bioensaio com os vírus recombinantes vsynlitx1 e vsynlitx Identificação de novas toxinas inseticidas do veneno de L. intermedia Ensaio hemolítico SDS-PAGE Western Blotting Seqüenciamento de proteínas Subclonagem do DNA da toxina LiD1 de L. intermedia no vetor de 73 transferência pfastbac TM 1 do sistema de expressão Bacto-Bac Atividade tóxica do veneno bruto de L. intermedia em linhagens 73 celulares de inseto

8 PÁGINA PCR para amplificação do DNA da região madura de LiD Purificação do produto de PCR Clonagem do produto de PCR de LiD1 no vetor de clonagem 76 pgem -T Easy Precipitação do produto de ligação Transformação química de bactérias Extração em baixa escala de plasmídeos (mini-prep) Digestão do vetor pgem -T Easy contendo a região madura de 79 LiD1 com BamH I Purificação do fragmento da região madura de LiD1 obtido pela 79 digestão do vetor pgem -T Easy com BamH I Digestão do vetor pfastbac TM 1 do sistema de expressão 79 Baculovírus Bac-to-Bac com BamH I Ligação do fragmento da região madura de LiD1 no vetor 81 pfastbac TM Precipitação do produto de ligação Transformação química de bactérias Extração em baixa escala de plasmídeos (mini-prep) Digestão do vetor pfastbac TM 1 contendo a região madura de 82 LiD1 com BamH I PCR para confirmação da correta orientação do inserto LiD1 no 82 vetor pfastbac TM Seqüenciamento automático capilar Produção de vírus recombinantes LiD1 em sistema Transposição Isolamento do DNA do bacmídeo recombinante Análise do DNA bacmídeo Transfecção de células Sf9 com o DNA bacmídeo recombinante Amplificação do estoque viral Extração de DNA de vírus secretados e não secretados Verificação por PCR da presença dos vírus recombinantes LiD1 89 no sistema Infecção de células de inseto com partículas virais 89 recombinantes

9 PÁGINA Análise da expressão das partículas virais recombinantes por 90 SDS-PAGE e Western Blotting 6. RESULTADOS Análises bioinformáticas de transcritos da glândula de veneno de 91 Loxosceles intermedia Obtenção das seqüências Tratamento das seqüências Agrupamento das seqüências Anotação dos uniques Classificação dos uniques Análises biológicas dos uniques classificados em categorias 95 funcionais Modelagem molecular dos uniques Atividade inseticida do veneno bruto de L. intermedia Análise de similaridade das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3 de L. 104 intermedia 6.4 Subclonagem do DNA das toxinas LiTx1 e LiTx2 de L. intermedia no 105 vetor de transferência psynxiv VI + X3 do sistema de expressão 6.5 Produção de vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em sistema Bioensaio com os vírus recombinantes vsynlitx1 e vsynlitx Identificação de novas toxinas inseticidas do veneno de L. intermedia Subclonagem do DNA da toxina LiD1 de L. intermedia no vetor de 121 transferência pfastbac TM 1 do sistema de expressão Bacto-Bac 6.9 Produção de vírus recombinantes LiD1 em sistema DISCUSSÃO Análises bioinformáticas de transcritos da glândula de veneno de 131 Loxosceles intermedia

10 PÁGINA 7.2 Atividade inseticida do veneno bruto de L. intermedia Análise de similaridade das toxinas LiTx1, LiTx2 e LiTx3 de L. 137 intermedia 7.4 Subclonagem do DNA das toxinas LiTx1 e LiTx2 de L. intermedia no 138 vetor de transferência psynxiv VI + X3 do sistema de expressão 7.5 Produção de vírus recombinantes LiTx1 e LiTx2 em sistema Bioensaio com os vírus recombinantes vsynlitx1 e vsynlitx Identificação de novas toxinas inseticidas do veneno de L. intermedia Subclonagem do DNA da toxina LiD1 de L. intermedia no vetor de 145 transferência pfastbac TM 1 do sistema de expressão Bacto-Bac 7.9 Produção de vírus recombinantes LiD1 em sistema Considerações finais CONCLUSÕES PERSPECTIVAS ANEXOS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 157