Bioinformática. João Varela Aula T4 CURSOS EM BIOLOGIA, BIOQUÍMICA, BIOTECNOLOGIA, CIÊNCIAS BIOMÉDICAS E ENGENHARIA BIOLÓGICA

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1 Bioinformática CURSOS EM BIOLOGIA, BIOQUÍMICA, BIOTECNOLOGIA, CIÊNCIAS BIOMÉDICAS E ENGENHARIA BIOLÓGICA João Varela Aula T4

2 Esquema de anotação Annothaton 1. Determinar a localização das ORFs presentes na sequência desconhecida (quadro de leitura; coordenadas do codão START e codão STOP) 2. Determinar qual delas tem maior probabilidade de ser a traduzida e ter função biológica

3 Esquema de anotação Annothaton 1. ORFs? Coordenadas? Quadro de leitura? Cadeia + ou -? (SMS ORF Finder) 2. Existem proteínas homólogas? (BLASTp, BLASTx) 3. Existem domínios funcionais? Onde? (InterProScan) 4. Qual o tamanho / massa molecular da proteína codificada pela ORF em aa / kda? 5. A que organismo ou táxon pertencerá a sequência metagenómica? (BLAST Taxonomy Report) 6. Relações filogenéticas (MSA; Prof. Rita Castilho) 7. Conclusões e Análise de Resultados (PONTO PRINCIPAL DA AVALIAÇÃO)

4 ORFs com função biológica: Critérios Tamanho: As ORFs maiores tendem ser aquela que tem função biológica; a probabilidade de ORFs com tamanho > 150 aa de ser uma ORF sem função [falso positivo] é muito reduzida; ORFs com tamanho < 60 aa têm pouca probabilidade de terem função Homólogas a ORFs com função conhecida: Alinhamentos com sequências com função conhecida -> BLAST e InterProScan

5 BLAST

6 Subrotinas do BLAST Sub-Tipo" Query " Base de dados" BLASTn (deve ser usada para comparar sequências de DNA com bases de dados de DNA)" BLASTp (deve ser usada para comparar sequências polipeptídicas com bases de dados de proteína)" DNA" Proteína" DNA" Proteína" BLASTx" (deve ser usada quando a BLASTn ou BLASTp não consegue encontrar sequências homólogas na base de dados) " TBLASTn (deve ser usada quando a BLASTp não consegue encontrar sequências homólogas na base de dados) " TBLASTx (deve ser usada quando a BLASTx não consegue encontrar sequências homólogas na base de dados) " DNA -> proteína" Proteína" DNA -> proteína" Proteína" DNA -> Proteína" DNA -> Proteína"

7 Subrotina a usar para determinar proteínas homólogas a ORFs Usar o BLASTp utilizando a sequência proteica obtida através da tradução virtual da ORF contra a base de dados SWISSPROT e NR ORF (sequência nucleotídica) 5 -AAG ATG GAA GGA TAA ACC-3 Tradução virtual in silico M E G * ORF traduzida virtualmente (ORF Finder) Ficheiro Bioinformático (FASTA) > Proteína x MEG* BLASTp

8 Análise de resultados do BLASTp

9 Análise de resultados do BLASTp Listagem de sequências homólogas (scores elevados e valores E << 10-2 ) è há sequências homólogas e com função conhecida è ORF provavelmente codifica uma proteína com a mesma ou uma função biológica semelhante às codificadas pelas sequências homólogas Listagem de sequências homólogas (scores elevados e valores E << 10-2 ) è há sequências homólogas e com função desconhecida è ORF provavelmente codifica uma proteína com a mesma ou uma função biológica semelhante às das sequências homólogas, mas essa função não é ainda conhecida Listagem com scores baixos e valores E > > não há sequências homólogas credíveis è ORF não implica que não tenha função biológica; apenas que não se conhecem sequências homólogas neste momento; para ORFs > 200 aa è ORFan

10 ORFan ORF que codifica uma proteína com um tamanho > 200 aa sem proteínas homólogas conhecidas

11 Anotação coding vs. noncoding 1. Sequência tem ORFs? è Não è noncoding ê Sim 2. A maior ORF > 60 aa? è Não è noncoding ê Sim 3. A maior ORF tem função conhecida? è Sim è coding ê Não 4. A maior ORF > 200 aa? è Simè coding ê Não 5. ORFan com outras ORFs mais pequenas? è Não è noncoding ê Sim 6. Repetir passos 1-5 com ORFs mais pequenas se houver sobreposição entre a ORFan e a ORF mais pequena

12 BLASTp vs. BLASTx Usar o BLASTp contra a base de dados ENV_NR se o BLASTp não encontrar proteínas homólogas à proteína codificada pela ORF em estudo Usar o BLASTx nos passos 3 e 4 se o BLASTp não encontrar proteínas homólogas à proteína codificada pela ORF em estudo

13 BLASTx Traduz uma sequência de DNA nos 6 quadros de leitura e compara cada um deles com base de dados de proteína Ideal quando há erros de sequenciação que mascaram ORFs 5 -ACT AGG AAC ATC CAT AAC ATG AAA TAA-3! T R N I H N M K *! L G T S I T * N!! * E H P * H E I!! 5 -ACT ATG GAA CAT CCA TAA CAT GAA ATA A-3! T M E H P * H E I! Tem um erro (falta um T)

14 Anotação coding vs. noncoding 1. Sequência tem ORFs com BLASTx? è Não è noncoding ê Sim 2. A homologia > 60 aa? è Não è noncoding ê Sim 3. A homologia tem função conhecida? è Sim è coding, * ê Não noncoding * - Anotar que há uma possível ORF que está truncada devido a erros de sequenciação ou que se está na presença de um pseudogene

15 Pseudogene Sequências com homologia com genes que codificam proteínas (com função conhecida), mas que devido a mutações perderam a capacidade de codificar uma proteína 5 -ACT AGG AAC ATC CAT AAC ATG AAA TAA-3! T R N I H N M K *! L G T S I T * N!! * E H P * H E I!! 5 -ACT ATG GAA CAT CCA TAA CAT GAA ATA A-3! T M E H P * H E I!

16 BLAST

17 Colocar a listagem dos resultados do BLAST em Raw Results na secção BLAST do Annothaton Para obter os resultados do BLAST em formato de texto clicar em Format Options e escolher a opção Alignment as Plain Text

18 Esquema de anotação Annothaton 1. ORFs? Coordenadas? Quadro de leitura? Cadeia + ou -? (SMS ORF Finder) 2. Existem proteínas homólogas? (BLASTp, BLASTx) 3. Existem domínios funcionais? Onde? (InterProScan) 4. Qual o tamanho / massa molecular da proteína codificada pela ORF em aa / kda? 5. A que organismo ou táxon pertencerá a sequência metagenómica? (BLAST Taxonomy Report) 6. Relações filogenéticas (MSA; Prof. Rita Castilho) 7. Conclusões e Análise de Resultados (PONTO PRINCIPAL DA AVALIAÇÃO)

19 Proteínas são formadas por módulos funcionais Urocinase (activador do plasminogéneo) ligação a aniões (ex. RNA) Plasminogéneo (hidrolisa fibrilhas de cóagulo) ligação a proteínas ligação a proteínas e fosfolípidos actividade proteolítica

20 Assinaturas / Motivos / Fingerprints Prot1 -ARTYRKAF-! Prot2 -ARTRQKAF-! Prot3 -ARTTFKAF-! Prot4 -ARYQLKAF-!! Motivo -ARTXXKAF-!! Prot5 -ASFQLAST-! Família X Contém um motivo ARTXXKAF Proteína que não pertence à Família X São apenas consensos de sequências Não é necessário que tenham uma função biológica definida

21 Domínios podem conter 1 ou mais assinaturas Domínios unidades biológicas com fronteiras bem definidas Domínios Estruturais Domínios Funcionais Conjuntos de subdomínios bem definidos Plasminogéneo (hidrolisa fibrilhas de cóagulo) ligação a proteínas ligação a proteínas e fosfolípidos actividade proteolítica

22 InterProScan Ferramenta que pesquisa domínios com função conhecida por comparação com várias bases de dados (ProDom, Pfam, PROSITE, HAMAP, PRINTS, PANTHER, PIRSF, SMART, TIGRFams, Gene3D, SUPERFAMILY) MALSSSKFGWYRDAQQALFT Base de dados de assinaturas ou motivos GWYRK Função X SKLYT Função Y ALTTSAKXXXXT Função Z

23 Bases de dados associadas à InterPro Pfam BD de domínios (divergentes) PROSITE BD de locais (sites) funcionais PRINTS BD de fingerprints ou motivos organizados hierarquicamente (superfamílias, famílias e subfamílias) HAMAP perfis criados manualmente TIGRFAMs utilizam HMMs (hidden Markov models) de proteínas com funções equivalentes

24 Definição de Família na BD InterPro Para uma proteína pertencer a uma dada família tem de conter todas as assinaturas típicas dessa família As assinaturas têm de cobrir > 80% da proteína > 90% das proteínas da família não podem possuir outros domínios que estejam ausentes nos restantes membros da família

25 Tipos de entradas na BD InterPro Famílias Domínios Regiões (quando não respeitam nem a definição de família, nem a definição de domínio) Repetições / sítios (sítios de ligação [de ligandos], sítios activos [enzimas], modificações póstraducionais [PTMs])

26 Organização hierárquica da InterPro Superfamílias / Famílias / Subfamílias Relação PAI/ FILHO Superfamílias são PAIS de Famílias Subfamílias são FILHAS de Famílias Um FILHO é um subconjunto do seu PAI definido por um conjunto de motivos (excepto os motivos que definem o seu PAI) Tem que haver uma sobreposição de motivos conservados em >50% entre PAI e FILHO e o FILHO tem de conter > 75% dos motivos do seu PAI

27 Exemplos Família X Domínio Y + Sítio de Ligação M Família Y Domínio Y + Repetição H Família Z Domínio Y + Sítio Activo G Superfamília Y Todas as proteínas que tenham o domínio Y

28 Como usar o InterProScan

29 InterProScan: Visual Output

30 InterProScan: Summary Table

31 InterProScan: Tool Output

32 Critérios de anotação de domínios proteicos Os domínios a anotar não podem estar sobrepostos Caso haja vários domínios não sobrepostos, anotar o domínio mais informativo (escolher o domínio que descreve uma enzima [ex. Succinato desidrogenase] em vez de uma família de enzimas [ex. Oxidoreductase]) Anotar o domínio com o valor E mais significativo Anotar apenas domínios que já estejam integrados na base de dados INTERPRO (nº de acesso com o formato IPRnnnnnn). Só anotar domínios não integrados caso não haja domínios integrados.

33 Esquema de anotação Annothaton 1. ORFs? Coordenadas? Quadro de leitura? Cadeia + ou -? (SMS ORF Finder) 2. Existem proteínas homólogas? (BLASTp, BLASTx) 3. Existem domínios funcionais? Onde? (InterProScan) 4. Qual o tamanho / massa molecular da proteína codificada pela ORF em aa / kda? 5. A que organismo ou táxon pertencerá a sequência metagenómica? (BLAST Taxonomy Report) 6. Relações filogenéticas (MSA; Prof. Rita Castilho) 7. Conclusões e Análise de Resultados (PONTO PRINCIPAL DA AVALIAÇÃO)

34 Massa Molecular (Molecular Weight) 1 Da = 1 unidade de massa atómica = 1/12 massa de um átomo de C massa de um átomo de H 1 mole de H tem uma massa de 1 g Logo: 1 Da => 1 g mol -1 A massa molecular de uma macromolécula depende do nº de unidades que a forma Mw Proteína = somatório da Mw dos resíduos de aa Mw DNA = somatório da Mw dos resíduos de nucleótidos Annothaton: anotar Mw - apenas se a ORF estiver completa!

35 A ORF está completa quando: Identificámos o seu codão STOP (a 3 ) Identificámos o seu codão START (a 5 ) O alinhamento múltiplo (MSA) com sequências homólogas não revela a falta de qualquer sequência

36 Determinação do codão START por MSA GOS_12345! BD_P0001! BP_P0002! Exemplo 1 Conclusão!MSAHNTMALAGHAHHHAIKLYVVFA!!MSAHYTMALVGHAHKHAIKLYVIFA!!MSAHYTMALVGHAHHHAIKLYVVFA! A ORF está completa na sua extremidade 5 Exemplo 2 Conclusão GOS_12345!! MALAGHAHHHAIKLYVVFA! BD_P0001!!MSAHYTMALVGHAHKHAIKLYVIFA! BP_P0002!!MSAHYTMALVGHAHHHAIKLYVVFA! A ORF está incompleta na sua extremidade 5 Exemplo 3 Conclusão GOS_12345!!MSAHNTMALAGHAHHHAIKLYVVFA! BD_P0001!! MALVGHAHKHAIKLYVIFA! BP_P0002!! MALVGHAHHHAIKLYVVFA! A ORF começa no 2º codão START

37 Alinhamentos de sequências múltiplas (MSA) Para que servem? Pesquisa de sequências adicionais Montagem de sequências genómicas Montagem de ESTs Pontos de partida para análises filogenéticas

38 Alinhamentos de sequências múltiplas (MSA) Pesquisa de sequências adicionais 5 -ACTGATTAGCAACTAAGGACATAAAACTGCTTAGCCAT-3! 5 -ACTGATTACCATACATTGACTTAACTGACTAATCTTAT-3! 5 -ACTGATTAGCATCCAAGGACATAAAACTGCTATGTTAT-3! Consenso ACTGATTASCAWMYAWKGACWTAAMWSWSYWWWSYYAT! primer, sonda (sequência comum usada para detectar famílias de genes [homólogos] por hibridação)

39 Alinhamentos de sequências múltiplas (MSA) Montagem de sequências genómicas 5 -AGCTATTACAGGAACTTGCACATGGGCTTAGCTAGCAAATTTAGC-3 seq123_67! seq123_24 5 -CTTGCACATGGGCTTAGCTAGCAAATTTAGCTAGCT-3! seq123_89 5 -CAAATTTAGCTAGCTTGCCATTA-3! seq123_67 + seq123_24 + seq123_89 = contig

40 ESTs (Expressed Sequence Tags) RNA1 RNA2 RNA3 RNA4... RNAn Extracção de RNA, Síntese de cdna cdna1 cdna2 cdna3 cdna4... cdnan Sequenciação 5 EST1-1 EST1-2 cdna1 5 Expressed Sequence Tags (fragmentos de sequências de cdna de RNAs transcritos de um dado tecido ou células) Célula

41 Alinhamentos de sequências múltiplas (MSA) Montagem de ESTs para a dedução de sequências completas de RNA transcrito numa célula / tecido Detecção de splicing alternativo

42 Esquema de anotação Annothaton 1. ORFs? Coordenadas? Quadro de leitura? Cadeia + ou -? (SMS ORF Finder) 2. Existem proteínas homólogas? (BLASTp, BLASTx) 3. Existem domínios funcionais? Onde? (InterProScan) 4. Qual o tamanho / massa molecular da proteína codificada pela ORF em aa / kda? 5. A que organismo ou táxon pertencerá a sequência metagenómica? (BLAST Taxonomy Report) 6. Relações filogenéticas (MSA; Prof. Rita Castilho) 7. Conclusões e Análise de Resultados (PONTO PRINCIPAL DA AVALIAÇÃO)

43 BLAST Taxonomy Reports

44 Lineage Report

45 A importância do Organism Report Score Valor E

46 Critérios de decisão de taxonomia da fonte biológica de sequências metagenómicas Escolher o táxon que tenha valores E e scores com diferenças significativas com os restantes taxa Caso haja apenas taxa com valores E e scores muito próximos (não significativos) essa sequência não é diagnosticante para esse táxon; por isso escolher um táxon mais abrangente

47 Esquema de anotação Annothaton 1. ORFs? Coordenadas? Quadro de leitura? Cadeia + ou -? (SMS ORF Finder) 2. Existem proteínas homólogas? (BLASTp, BLASTx) 3. Existem domínios funcionais? Onde? (InterProScan) 4. Qual o tamanho / massa molecular da proteína codificada pela ORF em aa / kda? 5. A que organismo ou táxon pertencerá a sequência metagenómica? (BLAST Taxonomy Report) 6. Relações filogenéticas (MSA; Prof. Rita Castilho) 7. Conclusões e Análise de Resultados (PONTO PRINCIPAL DA AVALIAÇÃO)

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