Transcriptase Reversa (DNA polimerase RNAdependente)

Transcrição

1 RT (transcrição reversa)-pcr Transcriptases reversas dos vírus AMV ( Vírus da Mieloblastose Aviária ) ou M-MuLV ( Vírus de Moloney da Leucemia do Ratinho ) podem ser usadas para produzir uma cópia de DNA complementar (cdna) a partir de um molde de RNA. 5 RNA + primer Transcriptase Reversa (DNA polimerase RNAdependente) 3 cdna 5 PCR

2 RT-PCR: para a síntese do cdna pode usar-se um oligonucleótido específico, oligo(dt) 15-18, ou oligonucleótidos aleatórios - oligo(dn) 6

3 RT-PCR em 1 passo vs. RT-PCR em 2 passos ºC min 95 ºC 95 ºC 5 min 2 min 55 ºC 1 min 72 ºC 1 min 72 ºC 5 min 4 ºC X ºC min 70 ºC 20 min PCR

4 F R GP TP Estudos de expressão e genes de referência. Os genes AGP6 e AGP11 são expressos unicamente no grão de pólen (GP) e tubo polínico (TP). A quantidade de cdna total usada em cada reacção de PCR deve ser equivalente em todas as reacções da experiência. Os genes de referência Ubc9 e Tub4 (housekeeping genes) são usados para uniformizar a quantidade de cdna em cada reacção

5 PCR com primers com adaptadores (para sequências de reconhecimento de enzimas de restrição, ou outro tipo de sequências) Locais ER PCR

6 5 -RACE RACE ( Rapid amplification of cdna ends ) é uma variação de RT-PCR que amplifica sequências de cdna desconhecidas correspondentes às extremidades 5 ou 3 do mrna

7 3 -RACE RACE ( Rapid amplification of cdna ends ) é uma variação de RT-PCR que amplifica sequências de cdna desconhecidas correspondentes às extremidades 5 ou 3 do mrna

8 PCR invertido (IPCR) M 1 2 Taq I Taq I Taq I Taq I Digestion R F R F Taq I 1350 Ligation 800 Taq I A B PCR F R To obtain the promoter region of CrPrx1, a modification of an IPCR method (Ochman et al., 1988; Triglia et al., 1988) was performed as follows: TaqI- or Sau3AI-digested plant DNA (0.2 mg) was diluted to 1 ng/µl in T4 DNA ligase buffer (New England Biolabs), incubated at 65 C for 5min, and then placed on ice for another 5 min. T4 DNA ligase was added (2 units) and the reaction mixture incubated for 16 h at 4 C. DNA was then ethanol-precipitated and finally resuspended in 20 µl of DNase-free ddh2o. PCR was subsequently performed on 7.5 µl of the ligated DNA preparation using an enzyme mixture of DNA polymerases (Taq and Tgo) with proofreading activity, according to the manufacturer s instructions (Expand Long Template PCR System; Roche Molecular Biochemicals). Forward and reverse primers were 367- CAGAAATCACTATGCAAACATGC and 146-GGCCGAGTTGTTTGAGCTAC, respectively (forward primer was specific for a sequence in the first intron).

9 PCR nested : 2 amplificações sucessivas: par de primers internos no 2º PCR: aumento da especificidade/validação de produto de PCR

10 PCR Multiplex: PCR com 2 a 20 pares de primers (várias reacções de PCR em simultâneo no mesmo tubo -> os amplificados têm que ter tamanhos diferentes) Verificar sequência dos primers in silico para possíveis interacções primer-primer Testar todos os amplificados separadamente usando o mesmo programa de PCR (idealmente não deve haver amplificados inespecíficos) Testar conjuntamente com todos os primers em concentrações equimolares e mesmo programa. Se alguns amplificados não aparecem (possivelmente os maiores) aumentar a concentração de primers para esses amplificados e limitar para os restantes. Outros variáveis: Temp. de emparelhamento e extensão, conc. tampão, conc. enzima, qualidade dntps.

11 PCR Multiplex: PCR com 2 a 20 pares de primers Multiplex PCR of human genomic DNA for six exons of the human dystrophin gene. All reactions were performed in duplicate as described in the text. M, 100 bp ladder; Lanes 1 & 2, unaffected individual; Lanes 3 & 4, affected individual 1; Lanes 5 & 6, affected individual 2; Lanes 7 & 8, affected individual 3.

12 PCR com primers degenerados para, por ex., isolar uma sequência génica num organismo quando só conhecemos a sequência desse gene em organismos relacionados; encontrar o maior número possível de sequências, traduzi-las, alinhálas, e procurar motivos conservados. Esses motivos podem ser locais adequados para desenhar primers degenerados Ex. W P F A Q TGG CCN TTY GCN CAR Quantos primers diferentes na mistura? a) 5 b) 12 c) 24 d) 48 e) 64 f) 96

13 PCR com primers degenerados Na figura encontram-se alinhadas parte das sequências da enzima triose fosfato isomerase, para diferentes espécies muito distantes na escala evolutiva Schizosaccharomyces_pombe Saccharomyces_cerevisiae Lactuca_sativa Chlamidomonas_reinhardtii Drosophila_melanogaster Homo_sapiens Bacillus_subtilis VVACIGETLADREANETITVVVRQLNAIADKVQN--WSKIVIAYEPVWAI VILCIGETLEEKKAGKTLDVVERQLNAVLEEVKD--WTNVVVAYEPVWAI VIACVGETLEQREAGTTMEVVAAQTKAIADKISS--WDNVVLAYEPVWAI VIACIGETLEQRNSGSVFKVLDAQMDALVDEVKD--WTKVVLAYEPVWAI VIACIGETLEEREAGKTNEVVARQMCAYAQKIKD--WKNVVVAYEPVWAI VIACIGEKLDEREAGITEKVVFEQTKVIADNVKD--WSKVVLAYEPVWAI PIICVGETLEEREAGKTNDLVADQVKKGLAGLSEEQVAASVIAYEPIWAI * ** * * * **** *** Schizosaccharomyces_pombe Saccharomyces_cerevisiae Lactuca_sativa Chlamidomonas_reinhardtii Drosophila_melanogaster Homo_sapiens Bacillus_subtilis GTGKTGTPEEAQEVHAEIRKWATNKLGASVAEGLRVIYGGSVTGGNCKEF GTGLAATPEDAQDIHASIRKFLASKLGDKAASELRILYGGSANGSNAVTF GTGKVASPAQAQEVHAGLRKWFCDNVSAEVSASTRIIYGGSVSGSNCKEL GTGVVASPEQAQEVHAYLRQYCAKKLGAAVADKLRIIYGGSVSDTNCKDL GTGQTATPDQAQEVHAFLRQWLSDNISKEVSASLRIQYGGSVTAANAKEL GTGKTATPQQAQEVHEKLRGWLKSNVSDAVAQSTRIIYGGSVTGATCKEL GTGKSSTAKDANDVCAHIRKTVAESFSQEAADKLRIQYGGSVKPANIKEY *** * * * ****

14 Genotipagem por PCR (ex. inserção Alu no locus PV92 do cromossoma 16) PV92 Alu Insertion A member of Alu repeat family Human-specific Alu insertion Found in a non-coding region of your DNA Not diagnostic for any disease or disorder 5 3 Alu Amplified Region

15 Genotipagem por PCR The PV92 Alu is dimorphic so there are two possible PCR products: 641 bp and 941 bp No insertion: 641 bp With Alu: 941 bp 300 bp Alu insert 641 bp 5 3 Alu Amplified Region

16 Genotipagem por PCR * Primers concatenados * Heteroduplex formado entre a cadeia de 641 bases e a cadeia de 941 bases

17 Alu Repeats Classified as SINEs (Short Interspersed Repetitive Element) Mobilized by an RNA polymerasederived intermediate (retroposition) Approx. 500,000 Alu copies per haploid genome, representing about 5% of the genome Named for the Alu I restriction site within the element

18 Evolutionary Significance of PV92 Alu Inserts Highly conserved Inserted in the last 1,000,000 years Genotypes (+/+, +/, / ) ou Used in population genetics, paternity analysis, and forensics

19 PCR com 3 primers: genotipagem de mutantes nulos de Arabidopsis por inserção de T-DNA (WT=selvagem; HZ=heterozigótico; HM= homozigótico) N - Difference of the actual insertion site and the flanking sequence position, usually bases MaxN - Maximum difference of the actual insertion site and the sequence, default 300 bps pzone - Regions used to pick up primers, default 100 bps Ext5, Ext3 - Regions between the MaxN to pzone, reserved not for picking up primers LP, RP - Left, Right genomic primer BP - T-DNA border primer LB - the left T-DNA border primer BPos - The distance from BP to the insertion site

20 PCR de sobreposição ( overlap PCR ) para ligação de 2 produtos de PCR PCR PCR Combinar Desnaturar/re-emparelhar Extensão (sem primers) PCR

21 PCR de sobreposição ( overlap PCR ) para ligação de 2 produtos de PCR com locais de restrição nos flancos ER PCR PCR Combinar Desnaturar/re-emparelhar Extensão (sem primers) PCR

22 Overlap PCR: mutagénese sítio-específica: as mutações são introduzidas pelos primers. PCR1 PCR2 Misturar Desnaturar Emparelhar Estender PCR3 mutações em aminoácidos > rastrear funções biológicas, alterações estruturais mutações silenciosas > introduzir locais de restrição, ajustar utilização de codões

23 Método de mutagénese dirigida baseado no princípio do megaprimer. Protocolo de Tyagi et al., (2004). BMC Biotechnology, 4:2 The first PCR (5 cycles) contains a limiting concentration of the first flanking primer and is followed by a prolonged extension step. The second flanking primer is then added and the entire mutated template is amplified by PCR (25 cycles). The second PCR product is digested with appropriate restriction endonucleases to give desired mutated fragment, which then can be ligated to the expression vector.

24 Mutagénese dirigida ( site-directed mutagenesis ) baseado na utilização da enzima de restrição DpnI

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26 Mutagénese dirigida ( site-directed mutagenesis ) baseado na utilização da enzima de restrição DpnI General notes: DpnI cleaves only when its recognition site is methylated. DNA purified from a dam + strain will be a substrate for DpnI.