Sistemas de clonagem em eucariotos e procariotos. Profa. Dra. Irene Soares FCF/USP

Transcrição

1 Sistemas de clonagem em eucariotos e procariotos Profa. Dra. Irene Soares (isoares@usp.br) FCF/USP

2 Isolamento de DNA Clonagem de DNA Transformação pelo DNA Seleção e análise de recombinantes Expressão de proteínas recombinantes Purificação de proteínas recombinantes Aplicações da tecnologia do DNA recombinante

3 Ferramentas básicas Gene de interesse Célula hospedeira (bactérias) Vetores de clonagem e expressão DNA ligases Enzimas de restrição Aparato de eletroforese de DNA Sondas de DNA, Primers

4 Isolamento de DNA DNA genômico cdna Produto de PCR Gene sintético Podem ser utilizados para construção de Bibliotecas de DNA

5 Vetores de clonagem Plasmídios: fragmentos de até 10 Kb Fago lambda: fragmentos de 5-20 Kb Cosmídios: fragmentos de Kb BAC (Bacterial Artificial Chromosomes): Kb YAC (Yeast Artificial Chromosomes): 100 Kb 1Mb

6 Componentes de um plasmídio Região promotora DNA exógeno DNA genômico, cdna, Produto de PCR, Gene sintético Plasmídios comerciais puc pgem pmos Sítio de Clonagem De até pares de bases Origem de replicação Gene que codifica resistência a antibiótico

7 Plasmídio para clonagem de produtos de PCR Sítio de Clonagem (polilinker)

8 Ligação Plasmídio linearizado Gene a se clonado DNA ligase Transferência do plasmídio para uma linhagem de bactéria DNA cromossômico Plasmídios recombinantes

9 Métodos de Transformação pelo DNA Tratamento com Cloreto ou Fosfato de Cálcio Bactérias (Escherichia coli) E. coli competente + DNA plasmidial Incubação no gelo Choque térmico (42ºC) Transformação direta por eletroporação

10 Métodos de seleção de recombinantes (bactérias transformadas) Bactérias: Baseado na resistência a antibiótico Bactéria SEM DNA plasmidial Bactéria COM DNA plasmidial Plasmídio religado (sem inserto) Plasmídio com inserto

11 Seleção azul e branca Gene lacz Gene lacz Inserto IPTG + X-gal Expressão da -galactosidase Não há expressão da -galactosidase Colônias azuis Colônias brancas

12 Seleção com sondas de DNA

13 Obtenção de DNA plasmidial Cultura bacteriana: E. coli contendo o plasmídio Lise alcalina: Fase estacionária (overnight)

14 Análise de restrição Enzima Sítio de restrição Fonte EcoRI G AATT C Escherichia coli RY13 C TTAA G NcoI C CATG G Nocardia corallina G GTAC C XbaI T CTAG A Xantomonas badrii AGATC T SmaI CCC GGG Serratia marcescens GGG CCC

15 5 - fosfato 3 - OH 5 - fosfato 3 - OH

16 Gel de agarose

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18 Eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídeo (exposto a luz UV)

19 Eletroforese em gel de agarose HindIII (-) Plasmídio Inserto Plasmídio não digerido

20 Mapeamento de restrição BstF5I SfaNI BbvI HpyCH4III TseI Fnu4HI BseMII MnlI AvaII EcoO109I BstYI PpuMI Sau3AI Sau96I DpnI NlaIV BsmFI Bsu36I Hpy188I DdeI AlwI ATGAGGGCATCCATCTTTCTCGCTCTTGCCATTCTCGTTATTACCGTTGTCGCTGCCCCTACCGATGATAAGGGACCTGAGGATCTGAAG 90 TACTCCCGTAGGTAGAAAGAGCGAGAACGGTAAGAGCAATAATGGCAACAGCGACGGGGATGGCTACTATTCCCTGGACTCCTAGACTTC È Ò Å Î É Â Å Â Å Â Ê È Ñ Ê Ê Å Å Ì Ñ Í Í Ò Ö Ì Í Í Â Ï Ó Ö Ç Ì Î É Í É Ì ˆ ˆ ˆ Ì ˆ Î Í Ì Â Ì È È Ò Í Â Ò È Œ Ò Í Ö Â Â Œ   Œ  Œ Ì Â Ó Á Ö Ñ Œ Ö Î Í Í

21 Sequenciamento do DNA T G G G G G T A C A T G C T C T C A C G T G 60 T T G CT GCA G T C A T G G C A T C C C G C A A A C A C A

22 Expressão de proteínas recombinantes Transformação Produção do antígeno in vitro Bactérias, leveduras ou baculovirus Purificação

23 Sistemas heterólogos de expressão Bactérias: Escherichia coli Leveduras: Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris Células de inseto (infectadas com baculovirus) Células de mamíferos Plantas Animais

24 Elementos genéticos essenciais em um vetor de expressão

25 Vetores indutíveis por IPTG (Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside) Operon Lac Na ausência de IPTG Na presença de IPTG

26 Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em fusão com GST Promotor Lac: Expressão em bactéria na presença de IPTG

27 Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em fusão com His-tag

28 Expressão de proteínas recombinantes em bactérias Considerações gerais: Bactéria: Escherichia coli (diversas linhagens) Vantagens: fácil manipulação, rápido crescimento, alto rendimento de proteínas e baixo custo Otimização da expressão: - Curva dose-resposta do indutor, tempo e temperatura de indução - Utilização de cepas de bactérias códon plus

29 Expressão de proteínas recombinantes em bactérias Considerações gerais: Desvantagens: Formação de corpos de inclusão proteínas insolúveis e não funcionais - Solubilização Proteínas solúveis - Refolding de proteínas Proteínas de fusão - Melhoram a solubilidade - Facilitam a purificação Corpos de inclusão

30 Cultura de bactérias (E. coli) Indução com IPTG Fase log: DO=0,4-0,6nm Expressão da Proteína recombinante Padronizar: Tempo, temperatura, curva-dose resposta de IPTG Lise (cong./descong., sonicação, French press) Avaliar em SDS-PAGE: extrato total, precipitado e sobrenadante Purificação

31 Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida

32 Análise da expressão da proteína recombinante em SDS-PAGE PM ,0 66,2 45,0 35,0 25,0 18,4 1. Extrato total (lisado bacteriano) 2. Sobrenadante 3. Precipitado (corpos de inclusão)

33 Métodos de detecção de clones recombinantes Reconhecimento por anticorpos específicos (ou anti-gst, anti-his) Função da proteína (ensaio enzimático) Seleção por PCR

34 Métodos de purificação de proteínas recombinantes Afinidade Troca iônica Fase reversa Gel filtração

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37 Etapas de purificação de proteínas recombinantes Extrato bacteriano Etapa final de purificação 1ª. Etapa de purificação

38 Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em leveduras (Pichia pastoris)

39 Expressão de proteínas recombinantes em leveduras Considerações gerais: Leveduras: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris Otimização da expressão: - Curva dose-resposta do indutor, tempo e temperatura de indução - Otimização do códon: mutagênese Vantagens (Pichia pastoris): altos níveis de expressão, modificações pós-traducionais (glicosilação, pontes dissulfeto), secreção da proteína

40 Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: terapêutica - Hormônio de crescimento humano e bovino (somatotrofina); - Insulina humana; - Calcitonina; - LH-RH - Somatostatina; - Gonadotrofina coriônica (HCG) e sérica (PMSG); - LH - Hormônio luteinizante bovino e suíno; - FSH Hormônio folículo estimulante humano e bovino; - IGF-I (Fator de crescimento insulina dependente); - Interferon alfa, Interferon beta e Interferon gama -Toxina Botulinica; - Eritropoietina; - Glucagon - Fatores de coagulação: VIII e IX

41 Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: diagnóstico laboratorial - HIV, HCV, HBV, HEV, HTLV, EBV, CMV, Rubéola - H. pylori, Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, Chlamydia - Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi

42 Hepatite B Gene Ag S Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: vacinas Purificação Vetor Vacina Proteína Levedura Antígeno S Pichia pastoris ou Hansenula polymorpha

43 Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: vacinas Engerix-B Recombivax HB GenHevac B SmithKline Beecham/US Merck/USA Pasteur/France Instituto Butantan

44 Aplicações da tecnologia do DNA recombinante: vacinas HPV HPV Os subtipos 16 e 18 estão implicados como causa de 70% dos cânceres de colo de útero

45 Dept. of Immunology Walter Reed Army Institute of Research Washington, DC