Terapia Gênica. Transferência de material genético para prevenir ou curar uma enfermidade. Isolamento e clonagem do gene alvo;
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- Lucas da Costa Covalski
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1 Terapia Gênica
2 Problemática Apenas algumas das mais de 6000 doenças humanas hereditárias são tratáveis Em muitas doenças não possível administrar o produto ausente ou anômalo Muitas enzimas são instáveis e não teriam atividade a longo prazo
3 Terapia Gênica Transferência de material genético para prevenir ou curar uma enfermidade. Procedimento padrão: Isolamento e clonagem do gene alvo; Inserção em vetor: vetores virais e não virais; Transferência: in vivo ou ex vivo.
4 A terapia gênica usa tecnologia de DNA recombinante O uso de genes como agentes terapêuticos para curar ou aliviar sintomas de doença chama-se terapia gênica. A terapia gênica somática visa às células somáticas, cujos descendentes não vão originar células germinativas. A estratégia alternativa para a terapia gênica, a terapia gênica germinal, visa às células germinativas, que originam os gametas. Por razões éticas apenas a terapia gênica somática tem sido tentada nos seres humanos.
5 Escolha de alvos para a Terapia Gênica Base genética: doenças monogênicas Identificação dos genes envolvidos. Biologia da doença: Quais são os tecidos afetados; Qual é o papel da proteína codificada pelo gene nas células e tecidos; Como as mutações interferem nas funções das proteínas; Acessibilidade do tecido alvo; Escolha do vetor.
6 A Chave para a Terapia Gênica: entrega do gene 1. Entregar o gene para a célula alvo. 2. Ativar o gene. 3. Integrar o gene nas células. 4. Evitar efeitos colaterais prejudiciais.
7 Métodos Um gene normal é inserido em uma localização não específica do genoma para cumprir o papel de um gene não funcional. Um gene anormal é substituído por um gene normal por recombinação. Um gene anormal é reparado por mutação reversa seletiva. Alteração da regulação da expressão de genes.
8 Vetores Virais Retrovirus: inserção randômica no genoma do hospedeiro.
9 Retrovirus: inserção randômica no genoma do hospedeiro. 1990: tratamento de SCID (Severe combined immunodeficiency) Gene ADA: adenosina deaminase inibe a proliferação dos linfócitos. Terapia gênica: introdução de cópia funcional do gene ADA.
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12 Efeito colateral: câncer Rompimento de genes supressores tumorais. Ativação de proto-oncogenes.
13 Adenovirus: expressão epissômica.
14 Vírus associados a adenovirus Parvovírus que dependem de adenovirus para replicação. Inserção sítio específica no cromossomo 19. Insertos pequenos (4,7 Kb).
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16 Vírus com proteínas do envelope modificadas Tipo de célula que pode receber o vetor. Vetores híbridos.
17 Fibrose Cística, Mucoviscidose ou Doença do Suor Salgado Uma doença hereditária que afeta as células dos pulmões, pâncreas, intestino delgado, fígado e órgãos reprodutivos. Secreção anormal de muco: tosse; digestão pobre e maior vulnerabilidade a infecções. Glândulas sudoríferas e as glândulas salivares: líquidos com teor em sal superior ao normal. Sem tratamento: infecções fatais nos pulmões e morte antes dos 20 anos.
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19 Incidência Europa e nos EUA: um a cada nascidos vivos e um heterozigoto a cada 25 pessoas. Sul do Brasil: um a cada 6800 nascidos vivos.
20 Genética da Fibrose Cística Muco anormal devido a mutação no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) no cromossomo 7. Mutação mais comum: deleção de três pares de bases: Gene normal 4443 pb Gene mutado 4440 pb: falta uma fenilalanina (ΔF508)
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22 Histórico da Terapia Gênica para Fibrose Cística 1993: adenovírus: resposta imune. 1995: lipossomos: baixos níveis e inflamações. 1998:vírus adeno-associados: baixa eficiência de transdução. 2009: vírus adeno-associado modificado e modelo animal (suínos).
23 2009: testes em humanos no Reino Unido e nos EUA. Vírus Adenoassociado com proteínas do envelope modificadas.
24 Células Epiteliais transfectadas com um plasmídio CFTR (verde)
25 Células Epiteliais marcadas com G449 CFTR (amarelo) e Tubulina (vermelho)
26 Suprimir a expressão gênica: degradação do RNAm - doenças monogênicas dominantes Doença de Huntington: Gene da hungtintina: extremidade 5' repetições CAG: glutamina expansão de poliglutamina (poliq). Com até 36 repeats: forma normal da huntingtina (Htt). Com 40 ou mais CAG repeats: forma mutante da huntigtina (mhtt) Agregados poliglutaminicos que se depositam no núcleo dos neurônios e provocam sua morte. Quanto maior o número de repeats mais precoce é a manifestação da doença
27 RNA de interferência
28 Problemas Vida curta da terapia gênica. Resposta imune e inflamatória. Expressão Gênica. Recuperação da capacidade patogênica. Doenças poligênicas. Em 1999: morte de paciente de 18 anos por falência múltipla de órgãos resposta imune ao vetor de adenovirus. Pacientes com leucemias secundárias.
29 Avanços Tratamento de cegueira genética: sucesso em cães. Linfócitos modificados para atacarem células cancerígenas. Tratamento eficiente de doenças de células mielóides. Cura de surdez em porquinhos-da-índia. Vetores lipossomais: doenças sistema nervoso central.
30 Vacinas de DNA Prevenção de doenças infecto-contagiosas. Induzem resposta imune. Plasmídios modificados: genes específicos para um ou mais antígenos de um patógeno selecionado.
31 Aplicadas por injeções intramusculares ou por um mecanismo conhecido como revólver genético: Plasmídeos dentro de microesferas de ouro e disparador de alta pressão. Lipossomos.
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33 Os antígenos podem entrar na corrente sanguínea. Podem ser quebrados em fragmentos e acoplados às proteínas do complexo de histocompatibilidade (MHC): Migram até a membrana celular: atuação das outras células do sistema imunitário.
34 Vantagens e Desvantagens Resposta imune eficiente: linfócitos B e T. Produção em larga escala: baixos custos. Imunidade a vários patógenos na mesma vacina. Citotoxicidade. Integração no genoma do paciente.
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