SEMINÁRIO. Bruno Becker 01/06/2016

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1 SEMINÁRIO Bruno Becker 01/06/2016 INTRODUÇÃO Engenharia Genética Domínio da estrutura e função dos genes Utilização de sistemas PROCARIOTOS e EUCARIOTOS Bactérias Fungos Células Animais Plantas e Animais Transgênicos Produção de Compostos de Interesse Proteínas recombinantes 1

2 Limitação dos atuais sistemas biotecnológicos Sistemas Eucariotos Sistemas Procariotos Fungos Animais Modificações Pós-Traducionais Variações no padrão de Glicosilação Dificuldades no ganho de escala Altos custos de manutenção Dificuldade na ampliação da escala Glândula Mamária Alta capacidade de produção de Proteínas (~30 g/l) Caseínas (24-28 g/l) Fácil obtenção Escala industrial do produto bruto REATOR BIOTECNOLÓGICO in vivo Produtos já comercializados Animais transgênicos Atryn (Antitrombina recombinante humana) Deficiência congênita que leva a tromboembolismo Ruconest (inibidor de esterase) Tratamento de Angioedema Obstáculos do uso de Animais Transgênicos 2

3 Estratégia para expressão de gene em animais lactantes Introdução de gene somático na células epiteliais secretoras utilizando-se vetores Imediata produção da proteína de interesse Vantagens Menores custos Rápido retorno Flexibilidade de escolha de proteínas 3

4 Estudos já realizados Transferência por lipofecção e eletroporação Sucesso na expressão transiente, mas baixo rendimento Uso de retrovírus Hormônio do crescimento em glândula mamária de caprino Exibe expressão transiente somente em células em divisão Necessita múltiplas aplicações do vetor Curto tempo de expressão e baixo rendimento Uso de adenovírus Não integram o genoma Sucesso em caprinos, coelhos e camundongos Níveis de produção comparados aos de animais transgênicos 4

5 ADENOVÍRUS Limitação Expressão transiente tempo médio 1 semana Máximo atingido de 3 semanas Temporada de lactação de caprinos e bovinos de 10 meses Ativação de resposta imune contra vetor ADENOVÍRUS ASSOCIADO SELVAGEM (saav) Não associado com doenças em humanos ou animais Baixa ativação imunológica Segurança no uso 92 ensaios clínicos com terapia gênica Características do saav DNA fita simples pequeno Não envelopado Pequeno (~4,7 kb) 2 regiões codificantes: rep e cap Proteínas não estruturais necessárias para replicação (REP) Proteínas estruturais do capsídeo (CAP) Flanqueadas por sequências palindrômicas terminais invertidas repetidas (ITR) 145 bp Adenovírus associado recombinante (raav) Regiões cap e rep substituídas por gene exógeno (~5kb) Não há replicação de proteínas virais Permite estabilidade do gene na forma epissomal e longa duração de expressão transiente 5

6 saav Mais de 100 sorotipos Variação da cadeia de aminoácidos do capsídeo Cada subtipo tem mais facilidade de transdução para determinado tipo celular AAV AAV5 E AAV8 Células epiteliais de pulmão, intestino e retina AAV9 células de pulmão Nenhum estudo demonstrou habilidade para células da glândula mamária. OBJETIVO Produção in vivo de Mielina Humana (hmbp) em glândulas mamárias de camundongos e coelhos por injeção de raav construídos a partir dos sorotipos AAV1 e AAV9. Demonstração da ausência de ativação imunológica através de reaplicação após fim da expressão transiente inicial. 6

7 MATERIAIS E MÉTODOS Construção de plasmídeos de raav 4 raav construídos separadamente Clonados em plasmídeos pam/cbl-pl-wpre bgh Preparação dos raav Plasmídeos de CBA-lacZ, CBA-GFP, CBA-hMBP, WAP-hMBP Plasmídeos de AAV1, AAV8 ou AAV9 Multiplicação dos plasmídeos Transfectados para células HEK293 Recuperação por coluna cromatográfica (raav 1 e 9) Recuperação por gradiente de iodixanol (raav8) Pureza visualizada em gel SDS-page Quantificação por PCR em tempo real 7

8 Transdução Injeção dos vetores em ductos mamários de animais anestesiados Estímulo a lactação induzido com ocitocina em camundongos Coleta do leite realizada por massagem na glândula mamária Ensaios proteicos Atividade de beta-galactosidase por ensaio enzimático in situ e por cortes histológicos Identificação e quantificação de MBP por Western Blott Corrida em gel SDS-Page Transferência para membrana Reação com anticorpos específicos e anticorpos secundários conjugados com peroxidase RESULTADOS Injeção de raav1-cba-lacz ( ) na glândula mamária de camundonga prenhe de 18 dias Glândula mamária coletada 13 dias após parto e coradas com galactose marcada (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β -D-galactoside in dimethyl sulfoxide) Mancha azul indicava presença de galactosidase tanto in situ como em cortes histológicos 8

9 Injeção de raav9-cba-gfp e raav8-cba-gfp ( ) na glândula mamária de camundongas prenhes de 18 dias Glândula mamária coletada 8 dias após parto e coradas com galactose marcada (vs. Controle) AAV9 (c) mostrou fluorescência; AAV8 (d), não Tanto AAV1 quanto AAV9 expressam em glândulas mamárias Escolheu-se AAV1 por maior disponibilidade para sequência de experimentos Com o objetivo de maximizar o rendimento do experimento inicial, optou-se pela utilização de 2 vetores com diferentes promotores para a produção de hmbp raav1-wap-mbp raav1-cba-mbp 9

10 Aplicou-se a mistura de vetores em fêmeas prenhes do dia 18, e em fêmeas 1 dia após o parto. Analisou-se o leite por Western Blott 1 semana após parto. Testou-se a aplicação individual dos promotores AAV1-WAP-MBP e raav1-cba-mbp, bem como a duração da expressão Utilização somente do vetor raav1-cba-mbp 10

11 Avaliou-se a produção contínua de hmbp por 8 semanas por amamentação cruzada de filhotes novos Avaliou-se o efeito em uma segunda lactação naturalmente ou com nova aplicação de raav1-cba-mbp 11

12 Mesmos experimentos realizados em coelhos Aumento de escala visando viabilidade comercial Injeção de vetor na glândula mamária de fêmea prenhe de 28 dias Amostras de leites tomadas a cada semana de lactação Lactação estendida por manutenção dos filhotes com a mãe por 21 semanas Quantificação da produção de hmbp através da comparação com amostras comerciais de concentração conhecida Concentração final de hmbp no leite de coelhas foi de aprox. 0,5 g/l, similar à concentração de 0,4 g/l em camundongas 12

13 DISCUSSÃO e CONCLUSÃO Produção de proteínas recombinantes movimenta um mercado bilionário altamente competitivo Várias estratégias de produção de fármacos biossimilares Modificações pós-traducionais exigem uso de sistemas eucariotos mais complexos A glândula mamária tem sido idealizada como o biorreator mais simples de recuperação dos fármacos, de menor custo e alta eficiência Utilização de vetores adenovírus tem retornado alta eficiência (4,8 g/l), porém de baixa persistência após 1 semana Queda de produção causada por resposta imunológica A utilização de vetor AAV demonstrou menor eficiência (0,5 g/l), porém com persistência ilimitada* enquanto houver lactação Queda somente observada quando cessa o estímulo de produção de leite pelas glândulas mamárias Permite a reutilização do mesmo animal Animais podem ser utilizados em sucessivas injeções com produtos diferentes, adequando-se as rápidas mudanças de necessidade do mercado 13

14 Animais maiores requerem maiores títulos de vetor viral para aplicação Alta demanda por vetor AAV em função do uso em terapias gênicas Acredita-se que com a maior demanda, o preço de aquisição dos vetores diminua Prover maior acesso econômico para a produção de biofármacos utilizando-se vetores raav em animais de produção, como caprinos, ovinos e bovinos A otimização do sistema raav e o aumento de escala para bovinos pode, em teoria já demonstrada com bovinos transgênicos, levar à produção de até 8 g/l de proteínas recombinantes (média de 20 L diários = 160 g de proteína/dia) Atryn (antitrombina humana) 1750 UI ao custo US$ 748,00 7 UI equivalem a 1 mg de proteína 1750 UI = 250mg = US$ 2.992,00/g Potencial teórico de receita de US$ ,00 AO DIA COM 1 ANIMAL 14

15 INDÚSTRIA FARMACÊUTICA DO FUTURO OBRIGADO 15