Plano de Aula. Apresentar conceitos. A transgênese em pequenos ruminantes: Discu;r os principais entraves. Considerações finais. Princípios. Métodos.

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1 Universidade Estadual do Ceará Faculdade de Veterinária Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias Biotécnicas Aplicadas à Reprodução de Fêmeas Caprinas e Ovinas Transgênese Vicente José de F. Freitas Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução

2 Plano de Aula Apresentar conceitos. A transgênese em pequenos ruminantes: Princípios. Métodos. Discu;r os principais entraves. Considerações finais.

3 Transgênese Ø Animais ou plantas Adição, troca ou ina;vação de um determinado gene. Maioria das vezes: OGMs são organismos transgênicos. Ø Transgênese animal Ø Possibilidades sem precedentes Ø Limitações é;cas e legais Legalização junto aos orgãos competentes Brasil CTNBio CQB (Cer;ficado de Qualidade em Biossegurança)

4 Aplicações da transgênese Ø Peixes transgênicos com fins comerciais GloFish com fluorescência vermelha: PET nos EUA Salmão (Salmo salar) transgênico para GH: Precoce para abate Aqua Bounty Technologies

5 Aplicações da transgênese Ø Camundongos transgênicos como modelo de estudo de funções gênicas e doenças humanas Camundongo transgênico para estudo de hipertrofia cardíaca (Dr. João Bosco Pesquero - UNIFESP).

6 Aplicações da transgênese Ø Suínos transgênicos para produção de órgãos humanizados para uso em xenotransplantes.

7 Aplicações da transgênese Ø Caprinos transgênicos para produção de proteínas recombinantes no leite. Lizosima humana (Dr. James Murray - EUA). Proteína da teia de aranha (Nexia Biotechnologies - Canadá) (Universidade de Wyoming - EUA).

8 Aplicações da transgênese An;- trombina III humana GTC Biotechnologies è revo 1º medicamento aprovado para uso humano a par;r do leite de animais transgênicos. Prevenção de eventos trombo- embólicos em cirurgias e no periparto de pacientes com deficiência hereditária de an;- trombina.

9 Por que a produção em animais? Aspectos Bactéria Levedura Cél. de inseto + baculovirus Nível de Produção Custo de Produção Cél. CHO Plantas transgênicas Animais transgênicos ++(+) ++(+) Scaling up Processamento pós- traducional Glicosilação Propriedade Intelectual Produtos no mercado Houdebine, 2008

10 Por que a produção em animais? Fucose Galactose Ác. Siálico Glic- Nac Manose Bactérias Xilose Insetos Plantas Mamíferos Proteína Houdebine, 2008

11 Qual espécie escolher? 1 L de leite/lactação 5 a 8 lactações/ano 1ª lactação: 6 meses 800 L de leite/lactação 1 lactação/ano 1ª lactação: 1 ano L de leite/lactação 1 lactação/ano 1ª lactação: 2,5 anos

12 Transgênese na espécie caprina Ø Principais caracterís;cas: Boa ap;dão leiteira Gestação: 5 meses # prolificidade (cabritos/parto) $ custo de manutenção # eficiência na microinjeção de DNA (x bovinos)

13 Métodos para obtenção Métodos clássicos: Microinjeção pronuclear Produção de zigotos (in vivo ou in vitro) Transferência nuclear de células somáticas (TNCS) Métodos alternativos: Transferência de genes mediada por espermatozoides.

14 Microinjeção pronuclear Fundadores Transferência para receptoras Microinjeção da construção de DNA Medicamento Purificação Leite Rebanho transgênico

15 Doadora de embrião pronuclear Microinjeção de embriões prónucleares colhidos de cabras Canindé (a) ou Saanen (b).

16 Doadora de embrião pronuclear Efeito da raça da doadora sobre a qualidade da microinjeção.

17 Doadora de embrião pronuclear Diagnós;co de prenhez, sobrevivência embrionária e parto em receptoras de embriões colhidos de cabras Canindé e Saanen.

18 Estudos nos fundadores e geração F1

19 Estudos nos fundadores e geração F1 Mean 690 μg/ml Dia - 20 Dia 0 Dinâmica do hg- CSF no leite de cabra transgênica durante a lactação induzida.

20 Estudos nos fundadores e geração F1 Teste de formação de colônia de granulócitos. Controle nega;vo (leite de cabra não transgênica), o leite de cabra transgênica (contendo 50, 100 e 200 ng/ml de hg- CSF) e o controle posi;vo (hg- CSF recombinante; Filgras;m, 50 ng ml).

21 Estudos nos fundadores e geração F1 Transmissão do transgene à descendencia das duas linhagens de caprinos transgênicos. Prenhezes Descendentes Descendentes por sexo (%) a Taxa de transgênicos (%) b M F M F Total 10M (54,5) 5 (45,5) 3 (50,0) 3 (50,0) 6 (54,4) 12F (50,0) 4 (50,0) 2 (66,7) 1 (33,3) 3 (37,5) Total (52,6) 9 (47,4) 5 (55,6) 4 (44,4) 9 (47,4)

22 Considerações A produção de proteínas recombinantes no leite de pequenos ruminantes transgênicos está aos poucos tornando- se uma realidade industrial. A dificuldade técnica e o custo da transgênese em animais domés;cos são as principais causas de sua len;dão de aplicação prá;ca. É necessário o desenvolvimento de métodos mais eficientes para melhorar o sucesso da técnica.