Criopreservação de embriões

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1 Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução Dr. Ribrio Ivan Tavares Pereira Batista 09/10/2014

2 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 2. PRINCÍPIOS DA CRIOPRESERVAÇÃO 3. TÉCNICAS DE CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES 4. FATORES QUE AFETAM O SUCESSO DAS TÉCNICAS 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

3 Introdução Criopreservação Etimologia da Palavra Ø Crio Grego Kryos gelado ou frio Conservação pelo congelamento Ø Preservar Conservar Como frio preserva a célula

4 Introdução Definição da criopreservação celular Ø Redução ou mesmo parada de todos os fenômenos biológicos (movimentos moleculares, reações químicas e atividades enzimáticas), as temperaturas inferiores a C.

5 Introdução Ø Histórico da criopreservação de embrião Embrião de camundongo (Whittingham et al., 1972) Embrião de bovino (Wilmut e Rowson, 1973) Embrião de ovino (Willadsen et al., 1976) Embrião de caprino (Bilton e Moore, 1976)

6 Introdução Vantagens da criopreservação de embriões 1. Otimização das biotecnologias reprodutivas (Lermen et al. 2009) 2. Conservação de material genético extinção/produção a. Preservação de raças em vias de extinção (Andrabi e Maxwell, 2007). 3. Prevenção de perdas de animais vivos durante o transporte (Chemineau et al., 1986) 4. Adequação a época de parições (Chemineau et al., 1986)

7 PRINCÍPIO DA CRIOPRESERVAÇÃO

8 Princípio da criopreservação Leis da termodinâmica Ø Protocolos de criopreservação de célula ü Suficientemente lento para prevenir a cristalização da água intracelular; ü Suficientemente rápido para prevenir a exposição das células a elevadas concentrações de eletrólitos antes da congelação;

9 Princípio da criopreservação

10 Princípio da criopreservação Molécula de água Cristal de gelo

11 Princípio da criopreservação Ø Aumento na concentração de eletrólitos

12 DANOS CAUSADOS PELA CRIOPRESERVAÇÃO

13 Princípio da criopreservação Danos causados pela criopreservação Lesões nas membranas

14 Princípio da criopreservação Danos causados pela criopreservação Desnaturação proteíca

15 Princípio da criopreservação Danos causados pela criopreservação Desnaturação do citoesqueleto

16 Princípio da criopreservação Danos causados pela criopreservação Sun X et al. Biol Reprod 2008;79:

17 PROTEÇÃO CONTRA DANOS

18 Princípio da criopreservação Ø Crioprotetores ü Proteção celular ü Reduzem a formação de cristais de gelo ü Reduzem do ponto crioscópico da água ü Maior estabilidade a membrana celular

19 Princípio da criopreservação Crioprotetores Substituem e/ou removem a água intracelular Intracelulares (penetrantes) Etilenoglicol, dimetilsufóxido, glicerol, propanodiol, butanodiol e metanol Extracelulares (não penetrantes) Lactose, glicose, sacarose, polivinilpirrolidona, manitol, trealose e albumina sérica bovina (BSA)

20 Princípio da criopreservação Crioprotetores Moléculas protetoras do citoesqueleto Citocalasina B

21 Princípio da criopreservação Toxicidade de Crioprotetores Concentração Entre 1 e 2 M Tempo de exposição 10 a 20 min Nível de toxicidade Etilenoglicol Glicerol Propilenoglicol

22 MÉTODOS DE CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES

23 Métodos de Criopreservação de Embriões Métodos de criopreservação Congelamento lento Criopreservação pelo método convencional Criopreservação pelo método One-Step Vitrificação Vitrificação em OPS Vitrificação em grade de microscopia eletrônica de transmissão Vitrificação em Cryollop Vitrificação em micropipetas de vidro GMP Vitrificação em superfície sólida de vitrificação SSV Vitrificação em Microgotas Vitrificação em himi-palhetas ( Hemi Straw )

24 Métodos de Criopreservação de Embriões Congelação lenta: Permitem a troca de água intracelular por crioprotetor, sem grandes efeitos osmóticos ou mudanças na forma celular, prejudiciais á funcionalidade das células.

25 Métodos de Criopreservação de Embriões Etapas de congelação lenta com etilenoglicol Procedimento: 1. Lavar embriões em PBS com 0,4% de BSA 2. Equilíbrio com 1,5 M de etileno glicol em PBS com 0,4% de BSA por pelo menos 5

26 Métodos de Criopreservação de Embriões Congelação lenta com etilenoglicol Procedimento: 3. Envase do embrião 4. Estabilizar a palheta no congelador de embriões á 6 ºC por 5 min

27 Métodos de Criopreservação de Embriões Etapas de congelação lenta com etilenoglicol Procedimento: 5. Realizar o seeding 6. Estabilizar por mais 5 min a 6 ºC

28 Métodos de Criopreservação de Embriões Etapas de congelação lenta com etilenoglicol Procedimento: 7. Iniciar curva de congelação (- 0,3 a - 0,6 ºC min) 8. Após atingir 32ºC, mergulhar palheta em N2 liquido (não tocar palheta com as mãos).

29 Métodos de Criopreservação de Embriões Etapas de congelação lenta

30 Métodos de Criopreservação de Embriões Etapas de descongelação lenta 1. Descongelação: 5 no ar e 30 em banho-maria a 35-37ºC 2. Palheta é montada diretamente no inovulador ; 3. Recomendado não levar mais do que 20 entre a descongelação e a inovulação; 4. Não existe avaliação prévia do embrião.

31 Métodos de Criopreservação de Embriões Ø Vitrificação Ø Estados físicos da matéria Ø Líquidos com alta viscosidade estado vítreo (amorfo) Ø Crioprotetores com alto grau de viscosidade

32 Métodos de Criopreservação de Embriões Vitrificação por OPS (Vajta, 1998). Ø Palheta de 0,25 ml esticada (diâmetro interno pequeno)

33 Métodos de Criopreservação de Embriões Etapa 1: Meio: 7,5% EG e 7,5% DMSO Tempo de exposição 1 min Etapa 2: Meio: 16,5% EG e 16,5% DMSO Tempo de exposição 20 s

34 Métodos de Criopreservação de Embriões Ø Reaquecimento Meios: SM Sacarose 0,5 M HM PBS + 5% SFB Procedimento: P1: 800 µl HM, 400 µl SM 5 min P1: 800 µl HM, 400 µl SM 5 min

35 Métodos de Criopreservação de Embriões Ø Vitrificação X Congelamento lento Ø Inconvenientes: Ø Ø Estresse osmótico Toxicidade químico de crioprotetor Ø Vantagens: Ø Ø Não precisa de um congelador programável Técnica muito rápida

36 Métodos de Criopreservação de Embriões Ø Vitrificação X Congelamento lento Tratamentos N Re-expansão (%) Eclosão 72 horas (%) Eclosão 72h + re-exppansão Controle 52-78,8 a 84,6 a Vitrificação 57 45,6 17,5 b 57,9 b Congelação lento 52 34,6 26,2 c 36,5 c Sobrevivência de embriões PIV criopreservados P < 0,05 Viana, (2006)

37 FATORES QUE INFLUENCIAM AS TAXAS DE SOBREVIVÊNCIA DE EMBRIÕES

38 Fatores que afetam sobrevivência do embrião q Estádio de desenvolvimento embrionário

39 Fatores que afetam sobrevivência do embrião q Estádio de desenvolvimento embrionário

40 Fatores que afetam sobrevivência do embrião q Qualidade do embrião

41 Fatores que afetam sobrevivência do embrião q Raça Bos taurus x Bos indicus q Raças zebuínas menor taxa de sobrevivência embrionária

42 Fatores que afetam sobrevivência do embrião q Origem do embrião Taxas de prenhes esperada após a transferência dos embriões congelados e descongelados de espécies de ruminantes domésticos para fêmeas receptoras sincronizadas Espécie Tipo de embrião Bovino (%) Ovino (%) Caprino (%) Produzido in vivo Produzido in vitro Youngs, 2011

43 Fatores que afetam sobrevivência do embrião q Zona Pelúcida (Pollard e Leibo, 1993)

44 Fatores que afetam sobrevivência do embrião q Meio de cultivo embrião in vitro q Meio de cultivo embrião in vitro q Presença de SFB Produção in vitro de embriões

45 Fatores que afetam sobrevivência do embrião q Momento da 1º clivagem pós-inseminação

46 Considerações finais Ø As técnicas de congelação lenta e vitrificação ambas são utilizadas para criopreservação de embrião. Ø A eficiência das duas técnicas podem variar de acordo com a origem do embrião (in vivo vs in vitro) e a espécie em questão.

47 Obrigado!!!

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