Transferência gênica mediada por espermatozóides (SMGT) e Nanotransgênese
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- Giovanni Amaral Zagalo
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1 Ministério da Educação Universidade Federal de Pelotas Centro de Desenvolvimento Tecnológico Curso de Graduação em Biotecnologia Disciplina de Transgênese Animal Transferência gênica mediada por espermatozóides (SMGT) e Nanotransgênese Prof. Vinicius Farias Campos
2 Objetivos da aula Histórico e Princípios da SMGT Fatores que afetam a SMGT Limitações e Perspectivas da SMGT
3 Transferência Gênica Local da Transferência Gênica Técnicas Usadas Embriões Gametas Células Microinjeção de DNA Infeção com retrovírus ou Lentivírus SMGT TMGT OMGT Células Germinativas Células-Tronco Embrionárias (ES) SCNT
4 Histórico da SMGT Descrito por dois pesquisadores independentes na década de 70 Captação de DNA viral por espermatozoides de coelhos em Brackett et al Captação de DNase I por espermatozoides de ouriço-do-mar - Spadafora & Geraci, 1975
5 Histórico da SMGT Captação de DNA viral por espermatozoides de coelhos em Brackett et al. 1971
6
7 Histórico da SMGT Captação de proteínas por espermatozoides de ouriço-do-mar Spadafora e Geraci, 1975
8 SMGT em diferentes espécies
9 Mecanismo SMGT
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11 Transferência gênica mediada por espermatozóides (SMGT) Construção gênica de interesse (DNA exógeno) 500 ng Sêmen 10 6 cells Fertilização in vitro Inseminação artificial
12 Transferência gênica mediada por espermatozóides (SMGT)
13 Questionamentos O que acontece quando misturamos o DNA exógeno com um espermatozóide? 2. Será que este DNA é internalizado pela célula ou fica ligado na membrana?
14 Transfecção de DNA Introdução de uma molécula de DNA exógeno no núcleo de uma célula O DNA exógeno entra no espermatozóide
15 SNP associado à SMGT
16 DNA exógeno internalizado por células espermáticas de touros
17 Métodos de Transfecção de DNA Eletroporação Lipofecção Incubação (DNA puro) Baixa eficiência para espermatozóides
18 Métodos de Transfecção de DNA O DNA exógeno está exposto
19 DNA exógeno exposto DNase Degradar o DNA exógeno
20 Atuação da DNase na evolução
21 Meio extracelular DNase no plasma seminal Meio intracelular DNase no citoplasma
22 Collares et al., 2010 Larvas de Jundiá expressando GFP
23 Expressão da GFP Será que a DNase do plasma INCUBAÇÃO DE DNA EXÓGENO NA PRESENÇA DE PLASMA SEMINAL seminal degrada o DNA exógeno?
24 Ação da DNase do plasma seminal no DNA exógeno C/ plasma S/ plasma C/ plasma S/ plasma Campos et al. (2011a)
25 O que fazer para vencer a DNase?
26 Nanotecnologia
27 Nanotubos
28 Dendrímeros catiônicos
29 Novas alternativas...
30 Sêmen Sexado Dependendo da aplicação do animal transgênico macho ou fêmea USO DE SÊMEN SEXADO PARA PRODUZIR BOVINOS TRANSGÊNICOS Sêmen sexado em bovinos COM SEXO PREDEFINIDO Comercialmente disponível Custos acessíveis
31 Aumento no número de embriões transgênicos usando nanotransfectantes
32 Como incrementar ainda mais este processo?
33 Metodologias da SMGT Técnicas para aumentar a transfecção de DNA para espermatozoides Remoção do plasma seminal Eletroporação Desidratação e reidratação Lipofecção, DMSO Linker-Based SMGT Anticorpos carreadores de DNA REMI-SMGT Lentivirus Aumento da permeabilidade da membrana ICSI-SMGT
34 Injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) Apenas o espermatozóide que contém o DNA exógeno injetado
35 ICSI-SMGT
36 Embriões transgênicos produzidos a partir da ICSI- SMGT
37 Fatores limitantes da SMGT As metodologias ainda não estão bem definidas DNases As taxas de integração do transgene no genoma hospedeiro ainda são baixas Consequentemente a expressão do transgene ainda é baixa
38 Perspectivas Nanobiotecnologia ICSI Semen sexado Técnica com futuro promissor devido à facilidade e ao baixo custo Provavelmente venha a ser a principal técnica usada na geração de animais transgênicos
39
40 Projetos em andamento UFPel Projeto: Produção de embriões bovinos transgênicos por NanoSMGT Coordenador: Vinicius Farias Campos Valor Financiado: R$ ,00 Origem: FAPERGS ARD 2012 Projeto: ICSI-NanoSMGT: Injeção intracitoplasmática de espermatozoides transfectados com nanotubos Coordenador: Vinicius Farias Campos Valor Financiado: R$ ,00 Origem: CNPq UNIVERSAL 2013
41 Resumo da aula Histórico da SMGT Como funciona a SMGT Transfecção de DNA para os espermatozóides DNases Nanobiotecnologia Semen sexado para produção de animais transgênicos com sexo predefinido ICSI-SMGT
42 Bibliografia sugerida
43 Obrigado pela atenção!!! Vinicius Farias Campos
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