Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas

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Ayrton da Rocha Antunes
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Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS Controle de Insetos Praga Mediado por RNA de interferência Aluno: Celso

1 Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas LGN SEMINÁRIOS EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS Controle de Insetos Praga Mediado por RNA de interferência Aluno: Celso Spada Fiori Orientador: Dr. Daniel Scherer de Moura Departamento de Genética Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: Piracicaba - São Paulo - Brasil Telefone: (0xx19) / 4125 / Fax: (0xx19)

2 Químico Aplicação de inseticidas Controle de Pragas Milho: Aprox. 60 milhões de dólares anuais (40% lagarta-do-cartucho) Biológico Utilização de controladores naturais Ex.: Vespa Cotesia flavipes no controle da Diatraea saccharalis Transgênicos Tecnologia Bt Ex. Algodão Bt resistente a inseto Integrado

3 Defesas Naturais das Plantas Físicas Cutícula Epiderme Espessa Tricomas Fibras Químicas Metabólitos Tóxicos e/ou Repelentes Nitrogenados Terpenóides Fenólicos

O Silenciamento Gênico Pós-Transcricional RNA dupla fita (dsrna): onde tudo começa DICER: A RNAse do processamento sirna: Em busca do alvo específico RISC

5 O Silenciamento Gênico Pós-Transcricional RNA dupla fita (dsrna): onde tudo começa DICER: A RNAse do processamento sirna: Em busca do alvo específico RISC (Complexo de silenciamento induzido por RNA) Complexo RISC: Localizando e eliminando os mensageiros Clivagem do mrna Silenciamento Gênico David Baulcombe, Nature

6 RNAi Um mecanismo suficientemente conservado! Plantas Insetos Nematóides Gordon & Waterhouse, Nature Biotech

7 Primeira Hipótese: Plantas Insetos Sileciamento Gênico na Lagarta! Possível! Porém, apenas em dietas artificiais com altas doses do sirna correspondente

8 Nova Hipótese Amplificação! Sileciamento Gênico na Lagarta! BINGO: Funciona!!

9 Precedentes Relativa Expressão Dias de dieta

11 Objetivo: Promover a morte das lagartas! Através de um RNA Inseticida Baum et al., Nature Biotech

Genes candidatos: Funções essenciais para a lagarta dsrna aplicado na dieta artificial em concentrações elevadas (520-780

12 Genes candidatos: Funções essenciais para a lagarta dsrna aplicado na dieta artificial em concentrações elevadas ( ng/cm 2 ) Alvos ideais: Silenciamento sob baixas quantidades de RNA -Diluições seriadas Baum et al., Nature Biotech

13 Determinação da DL50 : Concentração causadora de 50% de mortalidade em 12 dias Anotação DL50 Dias Controle Tubulina dsrna ATPase dsrna Baum et al., Nature Biotech

14 Foram geradas plantas Transgênicas expressando dsrna para silenciamento do gene V-ATPase A ~1000 ovos Transgênica Selvagem Resistente Selvagem Transgênica Dano Radicular Relativo Baum et al., Nature Biotech

Coevolução inseto-planta Como o inseto resiste aos metabolitos de defesa das plantas? Exemplo: Helicoverpa armigera Tolera o gossipol produzido pelo algodão?

15 Coevolução inseto-planta Como o inseto resiste aos metabolitos de defesa das plantas? Exemplo: Helicoverpa armigera Tolera o gossipol produzido pelo algodão? Análise da tolerância da lagarta ao Gossipol: Como ocorre essa tolerância? (em dieta artificial) Ganho de peso (mg) P450 Monooxygenases: Enzimas envolvidas na adaptação a inseticidas e metabólitos naturais s/ glândulas c/ glândulas Ganho de peso (mg) Ganho de peso (mg) Mao et al., Nature Biotech

Gossipol Dentre os genes diferencialmente expressos CYP6AE14 Expressão de CYP6AE14 é

16 Neste caso específico, estaria a P450 Monooxigenase participando da tolerância ao gossipol? Respondendo Experimentos: Biblioteca de cdna de intestino de lagartas expostas ou não ao Gossipol Dentre os genes diferencialmente expressos CYP6AE14 Expressão de CYP6AE14 é dependente de dose: P450 Monooxigenase...e tecido específica: mg/g de gossipol Mao et al., Nature Biotech

17 Existe relação do crescimento da lagarta (H. arimgera) com a expressão desse gene? Ganho de peso (mg) Ganho de peso (mg) Outra Monooxigenase envolvida? Existe especificidade? Mao et al., Nature Biotech

18 Provada a necessidade de alta expressão do gene para tolerância, o silenciamento deste deve reduzir a resistência ao gossipol! Hipótese: Alimentar a lagarta com plantas transgênicas expressando o dsrna do gene necessário à adaptação Plantas transgênicas: dsgfp (controle) dscyp6ae14 Plantas de Arabidopsis e Tabaco sem fenótipo aparente Mao et al., Nature Biotech

Selvagem Transgênica O dsrna produzido pela planta pode

19 Análise dos transcritos do gene no intestino da lagarta: Alimentadas com: E da proteína: Alimentadas com plantas: Selvagem Transgênica O dsrna produzido pela planta pode efetivamente silenciar o RNA da lagarta ao ser ingerido! Mao et al., Nature Biotech

20 Influência no desenvolvimento da lagarta Ganho de peso (mg) Ganho de peso (mg) Plantas transgênicas de algodão, expressando o dsrna do gene CYP6A14 das células do intestino de lagarta, apresentam relativa resistência a essa praga! Mao et al., Nature Biotech

21 Conclusões A utilização de RNAi no controle de insetos apresenta grande potencial Este sistema apresenta vantagens: -Não requer a aplicação de um segundo componente. -Não depende da produção de nenhuma proteína pela planta -Alta especificidade (apenas organismos alvo) -Reduzida pressão de seleção

22 Perspectivas Aumento da eficiência de controle Teste de viabilidade em campo Potencial extensão a demais insetos, fungos, bactérias e virus.

23 Obrigado! Dúvidas?

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