Figura 7: Purificação da proteína recombinante MscuOBP8 por HPLC. Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS PAGE Mini-PROTEAN TGX Gel Any kd

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1 Figura 7: Purificação da proteína recombinante MscuOBP8 por HPLC. Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS PAGE Mini-PROTEAN TGX Gel Any kd TM (BIO-RAD, USA) submetido à 100 V por 40 minutos e corado com Comassie Blue R-250 (BIO-RAD, USA) das frações da purificação da proteína MscuOBP8 (1-3A) e Western Blot das correspondentes frações utilizando anticorpo anti-his (1-3B). Marcador em kda. 97

2 Figura 8: Detecção da proteína nativa MscuOBP8 em diferentes estágios larvais do desenvolvimento de Melipona scutellaris. ELISA realizado utilizando o anticorpo monoclonal anti-mscuobp8 gerado a partir de uma biblioteca de scfv. Estágios do desenvolvimento: L2 - larva de segundo estágio; L3 - larvas do terceiro estágio (1,2 e 3 representam subdivisões do terceiro estágio); LPD - larva pré-defecante; LD - larva defecante; OBP8: detecção da proteína recombinante purificada; Controle + : detecção do anticorpo anti- MscuOBP8; controle - : tampão carbonato/bicarbonato (controle negativo da reação). 98

3 Figura 9: Estrutura 3D da proteína MscuOBP8 de Melipona scutellaris. Na figura está evidenciado a cavidade de ligação à compostos hidrofóbicos (rosa), os aminoácidos hidrofóbicos que formam a camada interna (verde) e os aminoácidos hidrofílicos que formam a camada mais externa da proteína (azul). 99

4 6 Tabela Table 1. Sequência dos oligonucleotídeos utilizados para amplificar a CDS dos genes CSP2, CSP6, OBP4 e OBP8 de Melipona scutellaris, desenhados com base no genoma de Apis mellifera. Gene/CDS Sequência de oligonucleotídeos (5 à 3 ) GenBank ID Tamanho esperado do fragmento AmelCSP2 Foward: GGATCCGATGGCTTCGGCAATCAAGC Reverse: GCGGCCGCCGAAACTCCGGCATACTG DQ pb AmelCSP6 Foward: GGATCCGATGAAGATTTATATTTTACT Reverse: GCGGCCGCATTATTTTTTGCAAATTGC DQ pb AmelOBP4 Foward: GGATCCGATGAAAATCACCATCGTCTC Reverse: GCGGCCGCATTTCCAGCAATCTTTTCT AF pb AmelOBP8 Foward: GGATCCGATGACGATTGAGGAGTTGAAGAAAAC Reverse: CGATAAGGAGCTCTACTTAGCTCCGGCGGCCGC AF pb rp49 Foward: CGTCATATGTTGCCAACTGGT Reverse: TTGAGCACGTTCAACAATGG AF pb 100

5 7 Concluões gerais As imagens da morfologia externa da cabeça da larva LPD nos permitiu detectar estruturas sensoriais que representa uma possível função olfatória em um estágio crítico no processo de diferenciação de casta em Melipona scutellaris, sendo o primeiro trabalho a apresentar a ultraestrura de larva em abelhas. Além disso foi o primeiro estudo a comparar a a ultruestrutura da antena entre os sexos e castas, apresentando a diversidade de sensilas presentes neste órgão sensorial, relacionando o sistema olfatório com uma possível função na diferenciação de castas em M. scutellaris. Detectamos e caracterizamos as sequências de nucleotídeos de quatro genes do sistema olfatório (MscuCSP2, MscuCSP6, MscuOBP4 e MscuOBP8) de M. scutellaris e predizemos, por bioinformática, as sequências de aminoácidos comparando com as sequências proteicas disponíveis de outras espécies de abelhas, quanto a similaridade, e concluímos que estas proteínas são altamente conservadas entre as abelhas. Expressamos a proteína recombinante MscuOBP8, selecionamos um anticorpo monoclonal contra esta proteínas e detectamos a proteína nativa em diferentes estágios do desenvolvimento larval de M. scutellaris. Verificamos que esta proteína encontra-se expressa nos estágios L2, L3-1, L3-2, L3-3, LPD e LD do desenvolvimento em níveis similares. A predição de um modelo tridimensional da MscuOBP8 evidenciou uma cavidade interna de ligação composta por aminoácidos hidrofóbicos e uma superfície externa composta por aminoácidos hidrofílicos, corroborando com a função carreadora de feromônios e semioquímicos das OBPs. Hipotetizamos, ainda que esta proteínas pode ter uma função importante no mecanismo de diferenciação de castas em M. scutellaris. Este trabalho abre novas perspectivas de estudos do sistema olfatório de M. scutellaris e seu possível papel na diferenciação de castas. 101