ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA ANÁLISES IN SILICO DAS MUTAÇÕES A4V E A4F DA PROTEÍNA SOD1

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Ângela Cordeiro Ferretti
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ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA ANÁLISES IN SILICO DAS MUTAÇÕES A4V E A4F DA PROTEÍNA SOD1 Aloma Nogueira Rebello da Silva Bióloga (UNIRIO) Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular

1 ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA ANÁLISES IN SILICO DAS MUTAÇÕES A4V E A4F DA PROTEÍNA SOD1 Aloma Nogueira Rebello da Silva Bióloga (UNIRIO) Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular aloma.nogueira@gmail.com Joelma Freire De Mesquita Pós-doutora em Sistemas Biomiméticos (USP) Doutora em Bioquímica (UFRJ) Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular e Celular Programa de Pós-Graduação em Neurologia joelma.mesquita@unirio.br OBJETIVO: Esse trabalho teve como objetivo realizar análises in silico das mutações da proteína SOD1 humana relacionadas ao desenvolvimento de esclerose lateral amiotrófica (ELA) e predizer os efeitos dessas mutações na estrutura, estabilidade e atividade proteica. METODOLOGIA: Seguindo a metodologia já estabelecida por nosso grupo (DE CARVALHO; DE MESQUITA, 2013; MOREIRA et al., 2013) pode-se determinar por modelagem computacional a estrutura tridimensional das proteínas com variações genéticas bem como predizer os efeitos funcionais destas mutações. Obtenção da sequência da SOD1 humana e compilação de mutações: A sequência da SOD1 humana foi obtida no banco de dados do UNIPROT (BATEMAN; MARTIN; ZHANG, 2015) (ID: P00441). A estrutura da proteína foi obtida no Protein Data Bank (PDB ID: 2C9V) (BERMAN et al., 2000) e a compilação das mutações foi realizada nos bancos de dados do ALSoD (ABEL et al., 2012) e UNIPROT. Predição funcional: O efeito das mutações na função da proteína foi predita utilizando os algoritmos PolyPhen-2, SNPeffect, PhD-SNP, SIFT, PredictSNP, SNPs&GO, nssnpanalyzer, MutPred, SNAP, I-MUTANT 2.0 e PROVEAN. Análise de conservação estrutural: A análise de conservação estrutural foi realizada utilizando o algoritmo ConSurf (ASHKENAZY et al., 2016), que determinou o grau de conservação dos aminoácidos da proteína SOD1 humana, baseado nas relações filogenéticas entre as sequências homólogas. Análise de flexibilidade estrutural: A análise de flexibilidade estrutural (Fator B), foi realizada de acordo com a metodologia descrita por (KREBS;

2 MESQUITA, 2016). Foram realizadas individualmente na proteína SOD1 nativa e nas mutações A4V e A4F. Alinhamento estrutural: O alinhamento estrutural foi realizado utilizando o algoritmo TM-align (ZHANG; SKOLNICK, 2005) que permite a análise entre uma estrutura molde (WT) e as estruturas mutantes A4V e A4F. São gerados valores como medida para interpretação dos resultados. Valores ideais de RMSD são 2.0Å e TM-score acima de 0,5 indicam similaridade topológica entre as estruturas. RESULTADOS: Obtenção da sequência da SOD1 humana e compilação de mutações - A SOD1 é uma proteína de 153 resíduos de aminoácidos. É um homodímero e cada monômero é composto por um loop de ligação a metal (resíduos 50-83) e um loop eletrostático (resíduos ) (CAO et al., 2008). Foram descritas mais de 170 mutações da proteína SOD1 humana. As mutações A4V e A4F são conhecidas como mutações do códon 4 no domínio n-terminal (Figuras 1). Predição funcional: O efeito das mutações não sinônimas da proteína SOD1 humana foi analisado por 11 algoritmos de predição, a fim de obter uma maior confiabilidade. O resultado dos algoritmos SNPs&GO, nssnpanalyzer, SIFT, PhD- SNP, PROVEAN, PolyPhen-2, PredictSNP e MutPred são mostrados na Figura 2. Como resultado do SNPeffect, os algoritmos LIMBO (tendência de ligação a chaperonas) e WALTZ (tendência a agregação amilóide) não apresentaram efeitos na proteína SOD1. O algoritmo TANGO (tendência a agregação) indicou que as duas mutações analisadas causaram um aumento da tendência a agregação da proteína SOD1. O FoldX e I- MUTANT indicaram redução na estabilidade da estrutura proteica. Análise de conservação estrutural: O modelo tridimensional da SOD1 (PDB ID: 2C9V) foi submetido ao Servidor ConSurf e os resultados são mostrados na Figura 3. As mutações estão localizadas em regiões altamente conservadas, o que pode explicar a relação entre essas mutações e o desenvolvimento da ELA. Análise de flexibilidade estrutural: O fator B analisa a flexibilidade estrutural durante a simulação através do chamado fator de Debye-Walle (PANG, 2016). Na figura 4, o Fator B indicou um aumento de flexibilidade nas variantes A4V (Figura 4B) e A4F (Figura 4C) em comparação com WT nos resíduos e uma diminuição na flexibilidade nos resíduos e Análise de alinhamento estrutural: Os modelos com mutação A4V e A4F apresentam alta similaridade estrutural com a WT. Na figura 5, as estruturas estão dispostas por meio de representação visual do alinhamento. O modelo com a mutação A4V (Figura 5A) apresentou valores de RMSD e TM-score de 1,86 e 0,916, respetivamente. O modelo com a mutação A4F (Figura 5B) apresentou um RMSD de 1,57 e um TM-score de 0,899, apresentando uma menor similaridade entre os resíduos

CONCLUSÃO: A predição funcional mostrou uma maior confiabilidade ao usar mais de um algoritmo para predizer os efeitos de mutações nas proteínas.

ao desenvolvimento de ELA. O resultado do Fator B sugere que as mutações alteram significativamente a flexibilidade dos resíduos proteicos em relação à WT.

3 CONCLUSÃO: A predição funcional mostrou uma maior confiabilidade ao usar mais de um algoritmo para predizer os efeitos de mutações nas proteínas. De acordo com a análise de conservação estrutural, as variantes estudadas estão em um resíduo altamente conservado da proteína SOD1, sugerindo que mudanças neste aminoácido podem estar relacionadas ao desenvolvimento de ELA. O resultado do Fator B sugere que as mutações alteram significativamente a flexibilidade dos resíduos proteicos em relação à WT. Portanto, esse estudo sugere que as mutações A4V e A4F na proteína SOD1 humana são patogênicas e alteram a estabilidade da estrutura proteica, o que poderia estar relacionado ao desenvolvimento de ELA. Figura 1. Estrutura da SOD1 humana. Modelo tridimensional da SOD1 humana (PDB ID: 2C9V). O aminoácido Alanina 4 foi destacado em vermelho. Figura 2. Número de predição de mutações A4V e A4F neutras e deletérias da proteína SOD1. O gráfico indica quantos algoritmos predizem se cada mutação possui efeito deletério ou efeito neutro na proteína SDO1. As barras azuis indicam predições neutras e as barras bordos indicam predições deletérias.

De acordo com a análise do servidor de Consurf, as mutações A4V e A4F estão em regiões conservadas. Figura 4.

4 Figura 3. Análise de conservação dos aminoácidos da SOD1. Três diferentes ângulos de visão são mostrados na figura da SOD1. Como a barra de codificação de cores mostra, bordô indica aminoácidos altamente conservados e turquesa indica posições variáveis. De acordo com a análise do servidor de Consurf, as mutações A4V e A4F estão em regiões conservadas. Figura 4. Representação de SOD1 colorida de acordo com o Fator B. As cores quentes indicam valores elevados de Fator B, enquanto que as cores frias indicam valores baixos de Fator B. (A) Proteína WT. (B) Mutante A4V. (C) Mutante A4F.

A B Figura 5 Alinhamento estrutural da proteína SOD1 e suas mutantes. (A) O modelo com mutação A4V (em rosa) e o molde 2C9V (em azul). (B) O modelo com mutação A4F (em verde) e o molde 2C9V (em azul).

5 A B Figura 5 Alinhamento estrutural da proteína SOD1 e suas mutantes. (A) O modelo com mutação A4V (em rosa) e o molde 2C9V (em azul). (B) O modelo com mutação A4F (em verde) e o molde 2C9V (em azul). As estruturas encontram-se alinhadas e representadas em estrutura secundária. REFERÊNCIAS: ABEL, O. et al. ALSoD: A user-friendly online bioinformatics tool for amyotrophic lateral sclerosis genetics. Human Mutation, v. 33, n. 9, p , ASHKENAZY, H. et al. ConSurf 2016 : an improved methodology to estimate and visualize evolutionary conservation in macromolecules. Nucleic Acids Research, v. 44, n. May, p , BATEMAN, A.; MARTIN, M. J.; ZHANG, J. UniProt: A hub for protein information. Nucleic Acids Research, v. 43, n. D1, p. D204 D212, BERMAN, H. M. et al. The protein data bank. Nucleic acids research, v. 28, n. 1, p , CAO, X. et al. Structures of the G85R Variant of SOD1 in Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis *. The Journal of biological chemistry, v. 283, n. 23, p , DE CARVALHO, M. D. C.; DE MESQUITA, J. F. Structural modeling and in silico analysis of human superoxide dismutase 2. PloS one, v. 8, n. 6, p. e65558, jan KREBS, B. B.; MESQUITA, J. F. DE. Amyotrophic Lateral Sclerosis Type 20 - In Silico Analysis and Molecular Dynamics Simulation of hnrnpa1. PLoS ONE, p. 1 18, MOREIRA, L. G. A. et al. Structural and functional analysis of human SOD1 in amyotrophic lateral sclerosis. PloS one, v. 8, n. 12, p. e81979, jan PANG, Y. Use of multiple picosecond high-mass molecular dynamics simulations to predict crystallographic B-factors of folded globular proteins. HLY, n. August, ZHANG, Y.; SKOLNICK, J. TM-align: a protein structure alignment algorithm based on the TM-score. Nucleic acids research, v. 33, n. 7, p , jan

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