Alinhamento de Sequências de Proteínas. Modelagem por homologia Estratégia/aplicação Etapas do processo Exemplo

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1 Objetivos FFI0776 Modelagem e Engenharia de Proteínas Prof. Rafael V. C. Guido rvcguido@ifsc.usp.br Aula 06 Alinhamento de Sequências de Proteínas Determinação da sequência de aa Características do alinhamento de aa Modelagem por homologia Estratégia/aplicação Etapas do processo Exemplo Bacharelado em Ciências Físicas e Biomoleculares Instituto de Física de São Carlos USP Determinação da Sequências de Aminácidos/Nucleotídeos N C Estrutura primária Conjunto de letras em sequência que representa os aminoácidos constituintes de uma proteína; A sequência que estão arranjados os aminoácidos contém toda informação necessária para a estrutura e função da proteína; A análise e comparação das sequências de aminoácidos de diferentes proteínas indicam como essas biomoléculas evoluíram e como a vida no planeta se desenvolveu N Sequência de aminoácidos C

2 Estrutura e Função Determinação da sequência de aminoácidos Estrutura primária Estrutura secundária Estrutura terciária Estrutura quaternária 1953 Frederick Sanger Determinação da primeira sequência de aminoácidos do hormônio insulina FUNÇÃO Descobrir a função a partir do conhecimento da estrutura primária Determinação da sequência de aminoácidos Determinação da sequência de aminoácidos Degradação de Edman Procedimento que marca e remove somente o resíduo N terminal marcado

3 Determinação da sequência de aa exemplo Determinação da sequência de aminoácidos Etapas 1. Hidrólisedaproteína da (mistura deaa) 2. Marcação e separação dos aa da mistura 3. Identificação e quantificação dos aa Cloreto de dabsila (corante) Cloreto de dansil (fluorecentes) Determinação da sequência de nucleotídeos Determinação da sequência de nucleotídeos PCR ddntps

4 Determinação da sequência de nucleotídeos Elucidação do código genético (genoma) Sequenciamento de DNA Isolamento de genes Dedução da cadeia polipeptídica pela determinação da sequência de nucleotídeos no gene Determinação da sequência de aa Além de indicar a estrutura e função de uma proteína, o conhecimento da sequência de aa sugere: localização celular (e.g., extracelular, intracelular, superfície celular) pontosde modificações pós traducionais (e.g., fosforilação, formação de pontes dissulfeto, glicosilação, sulfatação, metilação) relação evolutiva entre as diferentes proteínas (e.g., g proteínas com > 30% de identidade sequencial tem alta probabilidade de serem evolutivamente relacionadas) Proteínas homólogas Proteínas homólogas exemplo Biomoléculas l que evoluíram de um ancestral comum; Sequência de aa entre duas proteínas homólogas pode ser: idêntica similar (vários níveis) diferente Similaridade sequencial entre proteínas homólogas é menos preservada quea similaridade estrutural Estrutura 3D é fundamental para a função específica da proteína tripsina quimotripsina Superfamília = tripsina similar serino proteases Identidade d sequencial il= 44%

5 Proteínas homólogas exemplo Proteínas homólogas subdivisão Alinhamento de Sequências P de Paralogos l Proteínas Ortologos Ot l Proteínas da mesma família presentes na mesma espécie (homólogos na mesma espécie) Superfamília = tripsina similar serino proteases Id tid d sequencial Identidade i l = 44% rmsd = 0,58 Å Identificação de proteínas homólogas Alinhamento sequencial Processo que compara duas (ou mais) sequências de aa de proteínas baseado nas características de similaridade (e.g., idênticos, similares e diferentes) entre os resíduos. Qualidade Q lid d do d alinhamento li h Pontuação positiva é atribuída para cada posição onde os resíduos de aa idênticos são alinhados Gap = intervalo inserido entre segmentos de aa, pertencentes a mesma cadeia polipeptídica, para otimizar o alinhamento entre sequências homólogas Penalidades são atribuídas em função do número de gaps introduzidos Alinhamento final alinhamento que apresenta pontuação ótima determinada pelo equilíbrio entre o número máximo de resíduos de aa idênticos alinhados com o menor número de gaps g p Proteínas da mesma família presentes em espécies diferentes (homólogos em espécie diferentes) tripsina e quimotripsina bovina GAPDH humana e de T. cruzi Matriz de alinhamento Matriz Dayhoff Desenvolvida Margaret Dayhoff em 1978 com base na investigação de mutações observadas em 71 famílias de proteínas relacionadas evolutivamente Valores > 0 aa que substituem uns aos outros q, com maior frequência, portanto, indicam que os resíduos substituídos são funcionalmente equivalentes

6 Matriz de alinhamento Mti Matrizes PAM (Point Accepted dmutation) ti ) baseadas na estimativa da taxa de mutação de aa entre proteínas relacionadas evolutivamente. São eficazes para pontuação' de similaridade entre sequências que divergiram ao longo da evolução Matriz de alinhamento Blosum (blocks substitution matrix) Blosum45, Blosum50 proteínas com iden dade sequencial (divergentes) Blosum62, Blosum80 proteínas com iden dade sequencial (homólogas) PAM250 o número subsequente a matriz PAM indica a quantidade de dados de sequências de proteínas alinhadas extrapoladas para um nível de 250 substituições de aminoácidos por 100 resíduos por 100 milhões de anos. Matrizes PAM seguidas de um número elevado (e.g., PAM250, PAM200, PAM 160 ) é ideal para sequências mais divergentes, enquanto as matrizes ti PAM seguidas de números menores (e.g., PAM30, PAM70) são mais apropriadas para avaliar sequências protéicas menos divergentes. Alinhamento sequencial Alinhamento sequencial Banco de dados Validação do alinhamento 1. Permutação dos resíduos de aa Sequências aleatórias; 2. Sequências aleatórias são alinhadas com a sequência original; 3. Pontuação do novo alinhamento (sequência aleatória/original). Parâmetro de avaliação Pontuação do alinhamento original deve ser significativamente maior que a pontuação dos alinhamentos obtidos pelas sequências aleatórias

7 Alinhamento sequencial Exemplo Modelagem por Homologia Modelagem por homologia de proteínas Procedimento computacional capaz de predizer a estrutura de proteínas baseado em sequências de aa e nas coordenadas 3D de proteínas relacionadas (homólogas) Modelagem por Homologia de Proteínas (Homology Modeling of Proteins) Modelagem de Proteínas Baseada no Conhecimento (Knowledge Based Protein Modeling) Modelagem Comparativa de Proteínas (Comparative Modeling of Proteins) Modelagem por homologia de proteínas Estratégia Utilizar o conhecimento disponível de estruturas 3D de proteínas homólogas para indicar a conformação de uma proteína tí de interesse cuja estrutura t ainda não foi idt determinada d por métodos experimentais. Aplicação Em geral, duas proteínas que compartilham 50% de identidade sequencial podem ter os Cα da região central ( core ) sobrepostos com valor de RMDS 1,0 Å Identificação/alteração funcional Predição dos efeitos de mutação Planejamento de moléculas bioativas Desenvolvimento de vacinas Predição de interações entre proteínas

8 Programas (softwares) MODELLER SWISS MODEL expasy org/workspace/ Sybyl p// p / Prime ICM Modelagem por homologia de proteínas Etapas envolvidas 1. Determinação de proteínas relacionadas (homólogas) 2. Alinhamento sequencialda proteínade interesse (target protein) com as proteínas de referências (template proteins) 3. Identificação de regiões estruturais conservadas (SCR, structurally conserved regions) e regiões estruturais variáveis (SVR, structurally variable regions) 4. Construção das regiões estruturais conservadas da proteínas de interesse utilizando as coordenadas das proteínas de referência; 5. Construção das regiões estruturais variáveis 6. Modelagem das cadeias laterais dos aa 7. Refinamento estrutural métodos de minimização de energia e dinâmica molecular 8. Validação do modelo construído Identificação das Estruturas Relacionadas Fluxograma Gaps amplos: identificação e inclusão de prot. de referência adicionais Alinhamento Sequencial (prot. interesse/referências) Alinhamento Estrutural (prot. interesse/referências) 1. Alinhamento sequencial Etapa fundamental da modelagem por homologia Identificação de sequências relacionadas e regiões de estrutura conservadas (SCR) Identidade sequencial 30% Refinamento Construção de Avaliação dos do modelo cadeias laterais gaps na estrutura Defeitos significantes: Reavaliação do alinhamento sequencial Validação Defeitos insignificantes: FINALIZADO Defeitos moderados: modificação do protocolo de refinamento

9 1. Alinhamento sequencial Fatores importantes A análise criteriosa i do alinhamento deve ser realizada para evitar a construção de modelos improváveis e.g., impedimentos estéricos, éi enovelamentos não favoráveis Fatores importantes: Analisar os gaps (> 2 3 aa) Gaps < 1 aa em estruturas secundárias (folhas β e α hélices) Resíduos de Prolina (Pro) na sequência de interesse alinhados em regiões de α hélices interrupção de α hélices Deslocamento > 2 aa dos resíduos Cisteínas (Cys) em relação a sequência referência interrupção de pontes disulfetos Deslocamento > 2 3 aa dos resíduos iônicos (Lys, Arg, Asp e Glu) em relação a sequência referência interrupção de interações iônicas No caso de enzimas, analisar os resíduos que fazem parte do sítio ativo Resíduos de Prolina (Pro) na sequência de interesse alinhados em regiões de α hélices interrupção de α hélices Asp 210 2,9 Å Arg 249 3,3 Å Deslocamento > 2 aa dos resíduos Cisteínas (Cys) em relação a sequência referência interrupção de pontes disulfetos Deslocamento > 2 3 aa dos resíduos iônicos (Lys, Arg, Asp e Glu) em relação a sequência referência interrupção de interações iônicas 2. Alinhamento espacial e construção preliminar (SCR) Construção da cadeia principal Construção do núcleo da proteína Região inacessível ao solvente Elementos de estrutura t secundária 3. Modelagem das regiões variáveis (SVRs SVRs) Análise de segmentos que apresentam extensão equivalente em estruturas homólogas conformação similar (transferência das coordenadas3d) Busca de alças em banco de dados (PDB) Construção por métodos de novo (e.g., g ab initio)

10 4. Construção das cadeias laterais Construção da cadeia lateral dos aa Os segmentos da cadeia polipetídica que apresentam resíduos de aa idênticos tem as coordenadas 3D das cadeias laterais desses aa da estrutura de referência transferidas para o modelo da estrutura de interesse 5. Modelagem das cadeias laterais Predição das conformações das cadeias laterais é a etapa mais difícil e desafiadora da modelagem por homologia; Cadeia lateral de diversos aa possuem um ou mais estados energéticos favoráveis (rotâmeros); Substituições conservativas (e.g., Ile/Val; Gln/Glu) Assume se se que a cadeia lateral na proteína de interesse apresenta a mesma conformação que aquela observada na proteína de referência Ile Val Gln Glu 5. Modelagem das cadeias laterais Substituições não conservativas (e.g., Lys/Val; Tyr/Glu) Utilização de biblioteca bbl de rotâmeros Tyr = 4 rotâmeros Asp = 5 rotâmeros Ile = 7 rotâmeros 5. Modelagem das cadeias laterais Arg = 33 rotâmeros Lys = 24 rotâmeros

11 6. Refinamento Refinamento Frequentemente, segmentos onde regiões estruturais conservadas e variáveis são conectadas apresentam impedimentos estéricos ou conformações energeticamente desfavoráveis; Minimização de energia é empregada para corrigir imperfeições no modelo 7. Validação do modelo Validação Detecção de aspectos conformacionais que diferem dos parâmetros padrões Distância de ligação Ângulos torsionais Contatos entre átomos Anolea Verify 3D edu/verify EVA PROCHECK srv/software/procheck/ WHAT IF MOLPROBITY Validação do modelo Gráfico Ramachandran Validação do modelo Gráfico Ramachandran Modelo por homologia Modelo experimental

12 Portal de Modelos por Homologia Portal de Modelos por Homologia cgi/index.cgi Modelagem por Homologia de Proteínas Exemplo Modelagem por homologia exemplo Receptores acoplados a proteína G (GPCRs) Receptores dopaminérgicos (D 2 ) Receptores serotonérgicos (5HT 1,2 ) Receptores histamínicos (H 1 ) Receptores muscarínicos (M 1 ) Até 2007 somente uma estrutura disponível no PDB havia sido determinada em alta resolução rodopsina bovina 2,80 Å (PDB ID, 1F88) Recentemente: Receptor β 2 adrenérgico humano (PDB ID, 2RH1) Receptor de adenosina A 2A humano (PDB ID, 3EML) Receptor rodopsina de lula Receptor β 1 adrenérgico de peru Receptor opsina bovina

13 Modelagem por homologia exemplo Modelagem por homologia exemplo Programa = Prime 1.6 (Schrӧdinger) Estrutura referência = Receptor β 2 adrenérgico humano PDB ID, 2RH1 resolução 2,40 Å Estruturas de interesse = Receptores acoplados a proteína G D2, D3, D4, 5 HT 1B, 5 HT 2A, 5 HT 2B, 5 HT 2C, M 1, H 1, e A 2A Validação Cadeias laterais = ajustadas manualmente (biblioteca de rotâmeros) MolProbity PROCHECK Modelagem por homologia exemplo Modelagem por homologia exemplo 5HT 1B 5HT 2A 5HT 2B 5HT 2C D 2 D 3 D 4 H 1 M 1

14 Modelagem por homologia exemplo Modelagem por homologia exemplo Modelo 5HT 2A Ti Triagem virtual com ligantes conhecidos 1049 ligantes (49 compostos bioativos) Docagem Molecular no Modelo 5HT 2A Identificou 29 dos 49 compostos bioativos Modelagem por homologia exemplo Modelagem por homologia exemplo Modelagem por homologia Experimental (raios X) rmsd = 2.2 Å

15 Próxima aula Aula Prática de Modelagem por Homologia Local: Laboratório 205 Horário: 10 12h