PAULO EDUARDO BRANDÃO, PhD DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA E SAÚDE ANIMAL FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA UNIVERSIDADE
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1 CONCEITOS EM EPIDEMIOLOGIA E FILOGENIA MOLECULARES PAULO EDUARDO BRANDÃO, PhD DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA E SAÚDE ANIMAL FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
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3 DEFINIÇÕES EM EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR 1. EPIDEMIOLOGIA QUAIS DOENÇAS? ESTUDO DE DOENÇAS EM POPULAÇÕES INFECCIOSAS, PARASITÁRIAS, TÓXICAS, DEGENERATIVAS, NEOPLÁSICAS ETC? TIPOS DE ESTUDOS? FREQÜÊNCIA DE OCORRÊNCIA CADEIA DE TRANSMISSÃO FATORES DE RISCO MODELOS MATEMÁTICOS MEDIDAS DE CONTROLE E PREVENÇÃO -ESTUDOS PROSPECTIVOS E RETROSPECTIVOS -ESTUDOS EXPERIMENTAIS -TESTES DIAGNÓSTICOS -ESTATÍSTICA -GEORREFERENCIAMENTO
4 DEFINIÇÕES EM EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR 2. BIOLOGIA MOLECULAR RAMO DA BIOLOGIA QUE ESTUDA MOLÉCULAS BIOLÓGICAS? QUAIS? ÁCIDOS NUCLÉICOS (RNA, DNA) PROTEÍNAS (ENZIMAS, ANTICORPOS, PROTEÍNAS ESTRUTURAIS) PARA QUE? ESTRUTURA, FORMA, FUNÇÃO, DISTRIBUIÇÃO, EVOLUÇÃO, INTERAÇÃO COM OUTRAS BIOMOLÉCULAS APLICAR TÉCNICAS LABORATORIAIS BASEADAS EM BIOMOLÉCULAS É ESTUDAR BIOLOGIA MOLECULAR? BIOLOGIA MOLECULAR DIAGNÓSTICO MOLECULAR
5 DEFINIÇÕES EM EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR 3. EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR? QUAIS DOENÇAS? ESTUDOS EPIDEMIOLÓGICOS COM PLANEJAMENTO, RESULTADOS E DISCUSSÕES APOIADOS EM TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR INFECCIOSAS, PARASITÁRIAS, TÓXICAS, DEGENERATIVAS, NEOPLÁSICAS ETC MAIS COMUNS -BASEADOS EM ÁCIDOS NUCLEICOS -TÉCNICAS LABORATORIAIS DE BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE
6 DEFINIÇÕES EM EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR BASEADA EM ÁCIDOS NUCLÉICOS APLICADA A DOENÇAS TRANSMISSÍVEIS DETERMINAÇÃO DA DINÂMICA DE TRANSMISSÃO -ESTUDOS DE FREQÜÊNCIA DE OCORRÊNCIA -CADEIA DE TRANSMISSÃO -ESTUDO DAS RELAÇÕES PARASITA- HOSPEDEIRO: ALTERAÇÕES EM FREQÜÊNCIAS E TRANSMISSÃO REFINAMENTO DE ESTUDOS EPIDEMIOLÓGICOS -MAIOR PODER DE DISCRIMINAÇÃO ENTRE PATÓGENOS -DETERMINAÇÃO DE FATORES DE VIRULÊNCIA
7 DEFINIÇÕES EM EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR APLICADA A DOENÇAS TRANSMISSÍVEIS RASTREAMENTO DE FOCOS MARCADORES MOLECULARES: > DISCRIMINAÇÃO: > CONFIANÇA -AMOSTRAS EM BAIXA QUANTIDADE -PATÓGENOS EM BAIXA QUANTIDADE -ESTADO DE CONSERVAÇÃO DAS AMOSTRAS CARACTERÍSTICAS DOS MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
8 DEFINIÇÕES EM EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR 4. TAXONOMIA RAMO DA BIOLOGIA QUE ESTUDA A CLASSIFICAÇÃO DE ORGANISMOS EM GRUPOS NATURALMENTE RELACIONADOS COM BASE EM FATORES COMUNS? COMO? -MORFOLOGIA -FISIOLOGIA -BIOLOGIA MOLECULAR UTILIZAR TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR DO GENE PARA CLASSIFICAR PATÓGENOS É EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR? TAXONOMIA MOLECULAR EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
9 DEFINIÇÕES EM EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR 5. FILOGENIA RAMO DA BIOLOGIA QUE ESTUDA AS LINHAGENS DE DESCENDÊNCIA ( RELAÇÕES DE PARENTESCO ) E EVOLUÇÃO DE UM DADO ORGANISMO? COMO? -MORFOLOGIA -FISIOLOGIA -BIOLOGIA MOLECULAR FAZER ÁRVORES FILOGENÉTICAS É EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR? TAXONOMIA MOLECULAR EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
10 DEFINIÇÕES EM EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR FILOGENIA MOLECULAR TAXONOMIA MOLECULAR + ESTUDO DE DOENÇAS EM POPULAÇÕES = EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR
11 MODELOS EVOLUTIVOS E MÉTODO DE DISTÂNCIA PARA QUE SERVE ESTA AULA? 1.ALINHAMENTOS (nt E aa) BASES BIOLÓGICAS ALGORITMOS 2. MODELOS EVOLUTIVOS APRESENTAR OS MODELOS MATEMÁTICOS UTILIZADOS PARA ESTABELECER RELAÇÕES ENTRE SEQÜÊNCIAS DE NUCELOTÍDEOS E DE AMINOÁCIDOS 3. MÉTODO DE DISTÂNCIA -EXPOR CONCEITOS EM ÁRVORES FILOGENÉTICAS -MÉTODOS DE DISTÂNCIA PARA ÁRVORES
12 ALINHAMENTOS CARACTER UNIDADE POSICIONAL DENTRO DE UMA SEQÜÊNCIA DE DADOS, HERDÁVEL DE 1 ORGANISMO P/ OUTRO ESTADOS FORMAS POSSÍVEIS DE UM CARACTER
13 ALINHAMENTOS POR EXEMPLO, CARACTER MEMBRO SUPERIOR DE VERTEBRADOS ESTADOS: ASAS, NADADEIRAS, BRAÇOS CARACTER COR DOS OLHOS ESTADOS: VERDE, CASTANHO, PRETO, AZUL CARACTER NUCLEOTÍDEO DA POSIÇÃO 428 EM UMA SEQÜÊNCIA DE DNA ESTADOS: A, T, G OU C
14 ALINHAMENTOS OU SEJA, EM UMA SEQÜÊNCIA DE DNA, OS CARACTERES SERÃO AS POSIÇÕES DOS NUCLEOTÍDEOS E OS ESTADOS SERÃO A, T, G OU C PARA CADA UMA DAS POSIÇÕES EM ESTUDOS COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO, CARACTER: PRESENÇA DE UM SÍTIO DE RESTRIÇÃO PARA 1 DADA ENZIMA ESTADOS: PRESENTE OU AUSENTE
15 ALINHAMENTOS
16 SEQÜÊNCIAS DE CARACTERES ALINHAMENTOS
17 ALINHAMENTOS CARACTER 1 MEMBRO SUPERIOR CARACTER 2 MEMBRO INFERIOR CARACTER 3 CAUDA CARACTER 4 COBERTURA CORPORAL SEQÜÊNCIA 1 SEQÜÊNCIA 2 SEQÜÊNCIA 3
18 ALINHAMENTOS SEQÜÊNCIA 1 SEQÜÊNCIA 2 HOMOLOGIA SEQÜÊNCIA 3
19 ALINHAMENTOS INSERINDO MAIS UMA SEQÜÊNCIA NO ALINHAMENTO:
20 CARACTER 1 MEMBRO SUPERIOR CARACTER 2 MEMBRO INFERIOR CARACTER 3 CAUDA CARACTER 4 COBERTURA CORPORAL SEQÜÊNCIA 1 SEQÜÊNCIA 2 SEQÜÊNCIA 3 SEQÜÊNCIA 4 INSERÇÃO? DELEÇÃO? INDEL GAP
21 ALINHAMENTOS ALINHAMENTO: POSICIONAMENTO DE CARACTERES EM UMA SEQÜÊNCIA DE CARACTERES SUPONDO HOMOLOGIA PARA CADA CARACTER/ POSIÇÃO/ SÍTIO POR QUÊ SEQÜÊNCIAS TÊM QUE SER ALINHADAS? FILOGENIA: ESTUDO DE PARENTESCO (=HOMOLOGIA) BASEADO EM CARACTERES DADOS PARA CONSTRUÇÃO DE FILOGENIAS (=ÁRVORES) DEVEM SER GERADOS A PARTIR DE COMPARAÇÕES ENTRE HOMÓLOGOS
22 ALINHAMENTOS INSERINDO MAIS UMA SEQÜÊNCIA NO ALINHAMENTO:
23 ALINHAMENTOS CARACTER 1 MEMBRO SUPERIOR CARACTER 2 MEMBRO INFERIOR CARACTER 3 CAUDA CARACTER 4 COBERTURA CORPORAL SEQÜÊNCIA 1 SEQÜÊNCIA 2 HOMOPLASIA SEMELHANÇA NÃO-HOMÓLOGA
24 MODELOS EVOLUTIVOS MODELO DE SUBSTITUIÇÃO: RELAÇÕES DE PROBABILIDADE DE SUBSTITUIÇÕES ENTRE AMINOÁCIDOS OU NUCLEOTÍDEOS PARA UM DADO ALINHAMENTO DE SEQUÊNCIAS FREQÜÊNCIA DE CADA ESTADO (NUCLEOTÍDEO OU AMINOÁCIDO) NÚMERO DE SUBSTITUIÇÕES CLASSES DE SUBSTITUIÇÕES PARA CALCULAR DISTÂNCIAS ENTRE SEQÜÊNCIAS É POSSÍVEL UM MODELO DE SUBSTITUIÇÃO GENÉRICO?
25 MODELOS EVOLUTIVOS PARA CADA ALINHAMENTO, HÁ UM MODELO EVOLUTIVO MAIS PROVÁVEL ESTIMADO A PARTIR DO CONJUNTO DE DADOS(ALINHAMENTO)
26 MODELOS EVOLUTIVOS-NUCLEOTÍDEOS DISTÂNCIA p p=numero DE CARACTERES DIFERENTES/ TOTAL DE CARACTERES
27 MODELOS EVOLUTIVOS-NUCLEOTÍDEOS KIMURA-2-PARÂMETROS -FREQÜÊNCIAS DE TRANSIÇÕES E TRANSVERSÕES SÃO DIFERENTES A β β T A T G C A β α β T β β α G α β β α α α α C β α β β β β β d=-(1/2)ln(1-2p-q)-(1/4) ln(1-2q) C β β G Nº transições Nº transversões
28 MODELOS EVOLUTIVOS-NUCLEOTÍDEOS DEMAIS MODELOS A T C G
29 MODELOS EVOLUTIVOS PARA NUCLEOTÍDEOS: ALINHAMENTO DE SEQÜÊNCIAS TESTE ESTATÍSTICO DE PROBABILIDADES MODELO EVOLUTIVO MAIS PROVÁVEL
30 MODELOS EVOLUTIVOS PARA QUE? SAÍDA DO SEQÜENCIADOR EDIÇÃO DE SEQÜÊNCIAS ALINHAMENTO MÉTODO DISTÂNCIA (USA MODELOS EVOLUTIVOS) MÁXIMA PARCIMÔNIA (NÃO USA MODELOS EVOLUTIVOS) MÁXIMA VEROSSIMILHANÇA (USA MODELOS EVOLUTIVOS) BAYESIANO (USA MODELOS EVOLUTIVOS) DENTRO DE CADA MÉTODO:ALGORITMOS s ÁRVORES
31 ÁRVORES ÁRVORE FILOGENÉTICA REPRESENTAÇÃO MATEMÁTICA PARA A RELAÇÃO ENTRE GRUPO DE ORGANISMOS/ SEQÜÊNCIAS -NÓ TERMINAL -TÁXON -OTU (OPERATIONAL TAXONOMIC UNIT) NÓS INTERNOS RAIZ
32 ÁRVORES POLITOMIA: 1 NÓ > 2 RAMOS ÁRVORE TOTALMENTE RESOLVIDA: 1 NÓ 2 RAMOS
33 ÁRVORES OS TAXA SÃO REALMENTE IDÊNTICOS POLITOMIA FALTA DE SINAL FILOGENÉTICO POLITOMIA PROFUNDA IDENTIDADE ENTRE SEQÜÊNCIAS POLITOMIA SUPERFICIAL SEQÜENCIAR GENES/ REGIÕES MAIS VARIÁVIES AUMENTAR O TAMANHO DA SEQÜÊNCIA
34 ÁRVORES ÁRVORES COM RAIZ ÁRVORE NÃO-ENRAIZADA: RELAÇÕES FILOGENÉTICAS PARA QUE SERVE? ÁRVORE ENRAIZADA:ESTABELCEIMENTO DE ORDEM DE DESCENDÊNCIA POLARIDADE DE UM CARÁTER DEFINIÇÃO DO SENTIDO DA EVOLUÇÃO DO MESMO ESTABELECIMENTO DE ANCESTRAIS E DERIVADOS
35 ÁRVORES ÁRVORES COM RAIZ FÓSSEIS RAIZ GRUPO-EXTERNO
36 MÉTODO DE DISTÂNCIA DEFINIÇÃO MÉTODO (=CRITÉRIO DE OTIMIZAÇÃO) PARA CONSTRUÇÃO DE ÁRVORES FILOGENÉTICAS BASEADO EM DISTÂNCIAS ENTRE SEQÜÊNCIAS DE CARACTERES -COMPUTACIONALMENTE RÁPIDO -EFICIENTE PARA EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR X REDUÇÃO DAS RELAÇÕES ENTRE SEQÜÊNCIAS PARA DISTÂNCIAS: PERDA DE INFORMAÇÕES EVOLUTIVAS MAIS REFINADAS (...)
37 MÉTODO DE DISTÂNCIA ALGORITMO UPGMA (UNWEIGHTED PAIR-GROUP METHOD WITH ARITHMETIC MEANS -ALGORITMO MAIS SIMPLES PARA O MÉTODO DE DISTÂNCIA -ORIGINALMENTE: CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS -TAXAS DE EVOLUÇÃO APROXIMADAMENTE CONSTANTES: RELAÇÃO LINEAR ENTRE DISTÂNCIA EVOLUTIVA E TEMPO DE DIVERGÊNCIA AGRUPAMENTO SEQÜENCIAL: IDENTIFICAÇÃO DOS 2 TAXA MENOS DISTANTES CONVERSÃO EM 1 ÚNICO TAXA E CÁLCULO DA d MÉDIA TODOS OS TAXA SERÃO IGUALMENTE DISTANTES DA ORIGEM DA ÁRVORE: ÁRVORE ULTRAMÉTRICA
38 MÉTODO DE DISTÂNCIA-EXEMPLO DE UPGMA SUPONDO 5 TAXA E SUAS DISTÂNCIAS p PARA nt: TÁXON 1 TÁXON 2 TÁXON 3 TÁXON 4 TÁXON 5 TÁXON 1 ID 0,05 0,06 0,08 0,08 TÁXON 2 0,05 ID 0,03 0,05 0,07 TÁXON 3 0,06 0,03 ID 0,05 0,07 TÁXON 4 0,08 0,05 0,05 ID 0,02 1º AGRUPAR OS 2 MAIS PRÓXIMOS 2º FAZER A MÉDIA DOS DOIS MAIS PRÓXIMOS PARA O SEGUINTE TÁXON 5 0,08 0,07 0,07 0,02 ID 1. MAIS PRÓXIMOS: 4 E 5 (p=0,02) DISTÂNCIA DE 4-5 PARA 1 = (0,08+0,08)/2=0,08 DISTÂNCIA DE 4-5 PARA 2 = (0,05+0,07)/2=0,06 DISTÂNCIA DE 4-5 PARA 3 = (0,05+0,07)/2=0,06 2. OS PRÓXIMOS MAIS PRÓXIMOS: 2 E 3 (p=0,03) DISTÂNCIA DE 2-3 PARA 1 = (0,05+0,06)/2=0,055 POR QUÊ NÃO SE CALCULA 2-3 PARA 4 E 2-3 PARA 5? POR QUE 4 E 5 JÁ SÃO MAIS PRÓXIMOS ENTRE SI E CONSTITUEM UM GRUPO
39 MÉTODO DE DISTÂNCIA-EXEMPLO DE UPGMA TÁXON 1 TÁXON 2 TÁXON 3 TÁXON 4 TÁXON 5 TÁXON 1 ID 0,05 0,06 0,08 0,08 TÁXON 2 0,05 ID 0,03 0,05 0,07 TÁXON 3 0,06 0,03 ID 0,05 0,07 TÁXON 4 0,08 0,05 0,05 ID 0,02 TÁXON 5 0,08 0,07 0,07 0,02 ID 3. DISTÂNCIA 4-5 PARA 2-3 DISTÂNCIA DE 4-5 PARA 2-3 = (0,05+0,05+0,07+0,07)/4=0,06 4. DISTÂNCIA 4-5 PARA (1, (2,3) DISTÂNCIA DE 4-5 PARA (1, (2,3) = (0,08+0,05+0,05+,08+0,07+0,07)/6=0,067
40 TÁXON 1 TÁXON 2 TÁXON 3 TÁXON 4 TÁXON 5 TÁXON 1 ID 0,05 0,06 0,08 0,08 TÁXON 2 0,05 ID 0,03 0,05 0,07 TÁXON 3 0,06 0,03 ID 0,05 0,07 TÁXON 4 0,08 0,05 0,05 ID 0,02 TÁXON 5 0,08 0,07 0,07 0,02 ID O COMPRIMENTO DO RAMO ENTRE TAXA OU GRUPOS DE TAXA SERÁ IGUAL À METADE DA DISTÂNCIA ENTRE ELES: DISTÂNCIA DE 4-5 PARA 1 = (0,08+0,08)/2=0,08 DISTÂNCIA DE 4-5 PARA 2 = (0,05+0,07)/2=0,06 DISTÂNCIA DE 4-5 PARA 3 = 0,05+0,07)/2=0,06 DISTÂNCIA DE 4-5 PARA 2-3 = (0,05+0,07+0,05+0,07)=0,06 DISTÂNCIA DE 4-5 PARA (1, (2,3) = (0,08+0,06+0,06)=0,067 DISTÂNCIA DE 2-3 PARA 1 = (0,05+0,06)/2=0,055? 0,06? 0,0275-0,015 = 0,0125 0,015 0, ,055/2=0,0275 1? 0,067/2-0,01 = 0,0235 0,01 0,01 4 5
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42 MÉTODO DE DISTÂNCIA QUAL A INTERFERÊNCIA DO MODELO EVOLUTIVO PARA OS MÉTODOS DE DISTÂNCIA? JC: d= -(3/4)ln[1-(4/3)p] K2P: d=-(1/2)ln(1-2p-q)-(1/4) ln(1-2q) COMPRIMENTO DOS RAMOS TODAS AS DISTÂNCIAS p DE TODOS OS TAXA DE UMA ANÁLISE SÃO MULTIPLICADOS POR UM MESMO FATOR DE CORREÇÃO A DISTÂNCIA É ENTÃO UTILIZADA PELO DADO ALGORITMO PARA CALCULAR O COMPRIMENTO DOS RAMOS E PARA POSICIONAR OS TAXA POSICIONAMENTO DOS TAXA (TOPOLOGIA, GEOMETRIA ÁRVORE)
43 CONCEITOS EM EPIDEMIOLOGIA E FILOGENIA MOLECULARES PAULO EDUARDO BRANDÃO, PhD DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA E SAÚDE ANIMAL FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO paulo7926@usp.br
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