UNIVERSIDADE DE SÂO PAULO INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÒGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E BIOLOGIA EVOLUTIVA

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1 UNIVERSIDADE DE SÂO PAULO INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÒGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E BIOLOGIA EVOLUTIVA BIO0452 Proteínas: estrutura; função e biologia celular ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS PROFESSORES RESPONSÁVEIS: Prof. Dr. Luis Eduardo Soares Netto APOIO Renato Mateus Domingos (aluna PAE) Simone Vidigal Alves (técnica de nível superior) Thiago Geronimo Alegria (técnico nível superior) SÃO PAULO 2016

2 Aula Prática 7 Estruturas proteicas quaternárias Textos de apoio: Objetivo: Visão geral de técnicas para análise de estruturas quaternárias de proteínas. Estratégia: Análise de estruturas proteicas por Cromatografia de Exclusão Molecular (Size exclusion chromatography SEC), Espalhamento Dinâmico de Luz (Dynamic Light Scattering) e SDS-PAGE. Introdução: A estrutura quaternária de uma proteína se define pelo arranjo espacial de subunidades (cadeias polipeptídicas independentes) e as interações que permitem a manutenção dessa estrutura. As cadeias que formam uma estrutura quaternária podem ser idênticas (homo complexos) ou diferentes (hetero complexos). (a) Cromatografia de Exclusão Molecular em HPLC e análise de raio hidrodinâmico por Espalhamento dinâmico de luz. Sistemas cromatográficos, por definição são compostos por duas fases: uma fase móvel e uma fase estacionária. No caso de cromatografia líquida, a fase móvel é um liquido e a fase estacionária é uma coluna. A Cromatografia de Exclusão Molecular (Size Exclusion Chromatography = SEC) separa as moléculas por tamanho e forma. Dessa forma, a retenção de proteínas é proporcional às massas das mesmas, embora a forma também interfira nesse processo. Já o espalhamento dinâmico de luz avalia as dimensões de partículas em suspensão. Observaremos os aparelhos e os procedimentos para realização dos experimentos. (b) Estudo de caso: avaliação de estrutura quaternária por SEC e SDS-PAGE. Inicialmente, um cromatograma de SEC de padrões de proteínas com massas conhecidas é realizado. IMPORTANTE: como nesses cromatogramas não estão presentes agentes desnaturantes como SDS, as proteínas migram no estado de oligomerização em que são mais estáveis e ativas. A análise do tempo de retenção (tempo que leva para a proteína/molécula passar pela coluna) é inversamente proporcional a massa das mesmas (como vimos na aula de purificação de proteínas). Sendo assim, é possível criar uma curva padrão para análise posterior de outras proteínas que se pretende determinar o grau de oligomerização (Figura 1). 2

3 A B C D Figura 1 (A) Cromatograma de exclusão molecular (ou cromatografia de filtração a gel) de proteínas cuja massa em condições nativas é conhecida. Thyr; Gama; Ova; Myo e B12. (B) OhrB de Chromobacterium violaceum na forma reduzida. (C) Prx3 de Saccharomyces cerevisiae na forma oxidada. (B) Prx3 de Saccharomyces cerevisiae na forma reduzida. Queremos determinar os graus de oligomerização das proteínas relativas ao cromatogramas descritos nos itens B,C e D. Os cromatograms dos itens C e D, referem-se a mesma proteína, em diferentes estados de oxidação. A partir do cromatograma obtido na corrida de proteínas-padrão (Figura 1 A) é possível obter a curva de massa x Tempo de retenção (Figura 2). 3

4 Log MW Disciplina BIO0452: Proteínas: estrutura; função e biologia celular IB-USP ,5 5 4,5 4 3,5 3 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5 11,5 12,5 13,5 Tempo de retenção (min) Figura 2 Gráfico que relaciona massa molecular da proteína versus tempo de retenção. A partir da eluição das proteínas padrão, foi obtido o gráfico acima. Por regressão linear, foi obtida a seguinte equação y = 9,272 0,473x para converter tempo de retenção (x) em log da massa molecular na base 10 (Log MW) A seguir, apresentamos a tabela com os dados dos pesos moleculares (MW) em Da do padrão e também os tempos de retenção do Padrão e das proteínas de estudo. Com base na reta (y = 9,272 0,473x) obtida a partir da corrida do Padrão de pesos, calcule a massa molecular (em Da) das proteínas de estudo segundo a Cromatografia de Exclusão Molecular e complete a tabela. Abaixo, temos SDS-PAGE em condições redutoras (na presença de DTT) das proteínas em estudo. Observe os mesmos, quais são os pesos (em kda) das proteínas? São os mesmos obtidos na Cromatografia de Exclusão Molecular? Explique. 4

5 Finalmente, apresentamos exemplos de experimentos de DLS e comparação com respectivos cromatogramas de amostras puras de proteínas: 5

6 ATIVIDADE EXTRA Análise de estrutura proteica secundária em plástico e in silico. Nessa atividade, vamos explorar outros métodos para analisar estruturas secundárias que já foram analisadas em aulas anteriores. 1- alfa Hélices Programa Coot visualização da nuvem eletrônica que permite a construção do modelo estrutural. 1- Abra a proteína com código PDB(1ZB9) 2- Selecione o resíduo 48 e prossiga de resíduo em resíduo, até ao resíduo 73 observando a nuvem e as interações que permitem a estabilização da estrutura secundária. 3- Avance para resíduos posteriores ao resíduo 73 e repare se estruturalmente são permitidas o mesmo tipo de interações Programa Pymol visualização das interações 1- Abra a proteína com código PDB (1ZB9) 2- Selecione intervalo de resíduos de 48 até Copie a seleção para objeto 4- Visualize como sticks 5- Detecte onde fica o N-terminal e o C-terminal da hélice alfa 6- Aponte as interações responsáveis pela formação desta estrutura e aponte as características de cada uma das extremidades 7- Finalmente visualize como cartoon 8- Identifique o modelo de plástico que corresponde a esse tipo de Estrutura Secundária 6

7 9- Identifique as interações no modelo de plástico 2- Folhas β Coot visualização da nuvem eletrônica que permite a construção do modelo estrutural. 1- Abra a proteína com código PDB(1ZB9) 2- Selecione o resíduo 82 e prossiga de resíduo em resíduo, até ao resíduo 105 observando a nuvem e as interações que permitem a estabilização da estrutura secundária. 3- Avance para resíduos posteriores ao resíduo 105 e repare se estruturalmente são permitidas o mesmo tipo de interações Pymol visualização das interações 1- Abra a proteína com código PDB (1ZB9) 2- Selecione intervalo de resíduos de 82 até Copie a seleção para objeto 4- Visualize como sticks 5- Aponte as interações responsáveis pela formação desta estrutura e aponte o que têm em comum as cadeias laterais dos resíduos responsáveis pela formação das Folhas β. 6- Finalmente visualize como cartoon 7- Identifique o modelo de plástico que corresponde a esse tipo de Estrutura Secundária 8- Identifique as interações no modelo de plástico 7