Extracção de lípidos 2
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1 1 Técnicas de separação e identificação dos constituintes moleculares das membranas Extracção de lípidos 2 Mistura de solventes orgânicos, com carácter anfipático Clorofórmio/metanol, a + utilizada
2 Métodos de extracção de lípidos 3 Folch et al. grande variedade de amostras, sobretudo tecidos animais J. Biol. Chem. (1957) 226, 497 (original) J. Lipid Res. (1964) 5, 318 (modificação) Reed et al. eritrócitos J. Lab. Clin.Med. (1960) 56, 281 CH 3 OH:CHCl 3 (1:2, vol.) CH 3 OH:CHCl 3 (1:1, vol.) Bligh & Dyer amostras com grande proporção de água endógena, ex. suspensões de bactérias CH 3 OH:CHCl 3 :H2O (2:1:0,4 vol.) Can. J.Biochem. Physiol. (1959) 37, 911 Métodos de extracção de lípidos 4 Diagrama do processo de extracção de lípidos pelo método de Bligh e Dyer modificado
3 Análise qualitativa de lípidos 5 Técnicas cromatográficas: Camada fina (TLC) Coluna GLC HPLC Análise qualitativa de lípidos 6 Cromatografia de camada fina Etapa I. Preparação das placas de cromatografia 1 2 aplicador Placas de vidro Sílica gel G (com binder) Sílica gel H (sem binder)
4 Análise qualitativa de lípidos 7 Cromatografia de camada fina Etapa II. Aplicação das amostras Cromatografia monodimensional Cromatografia bidimensional Análise qualitativa de lípidos 8 Cromatografia de camada fina Etapa III. Desenvolvimento das placas
5 Análise qualitativa de lípidos 9 Cromatografia de camada fina Resumo Análise qualitativa de lípidos 10 Cromatografia monodimensional
6 Análise qualitativa de lípidos 11 Cromatografia bidimensional Análise qualitativa de lípidos 12 Cromatografia de camada fina Etapa IV. Detecção dos lípidos nos cromatogramas Métodos inespecíficos: Pulverização com água Pulverização com Rodamina B (0,05% em 95% etanol) Atmosfera de iodo Ácido sulfúrico + aquecimento Métodos específicos: Reagente azul de molibdato Reagente de ninhidrina Reagente de difenilamina ou reagente de α-naftol Reagente de periodato de Schiff
7 Análise de lípidos 13 Cromatografia gás-líquido Características: Boa resolução Grande sensibilidade Rapidez Reprodutibilidade Princípio: Cromatografia de partição F. estacionária: líquido (alto p. ebulição) adsorvido a suporte sólido / Fase móvel: gás Requisitos: Compostos a analisar no estado gasoso (ácidos gordos convertidos em metilésteres) Cromatografia gás-líquido 14
8 Lipossomas e vesículas 15 Preparação de lipossomas (MLV) Evaporação sob vácuo parcial em evaporador rotatório Fosfolípido puro ou mistura de lípidos em CHCl 3 ou CH 3 OH Suspensão leitosa de lipossomas Adição de tampão e ressuspensão do resíduo lipídico Resíduo seco no fundo do balão Factores importantes: agitação, temperatura e ph Lipossomas e vesículas 16
9 Reconstituição de proteínas em vesículas lipídicas 17 Proteína de membrana biológica isolada e purificada artificialmente introduzida em membrana de composição lipídica definida Função característica recuperada--- proteína reconstituída! Reconstituição de proteínas em vesículas lipídicas 18 Etapas: 1. Isolamento e purificação da proteína 2. Recombinação da proteína com meio lipídico definido 3. Isolamento das membranas reconstituídas
10 Reconstituição de proteínas em vesículas lipídicas Isolamento e purificação da proteína a) Solubilização da membrana com detergentes b) Isolamento da proteína por cromatografia (Cromatografia em gel ou de afinidade em coluna) Cromatografia por filtração em gel (gel filtration or size exclusion chromatography) Isolamento de macromoléculas 20 Cromatografia por troca iónica (ion exchange chromatography)
11 Cromatografia de afinidade Isolamento de macromoléculas 21 Cromatografia de afinidade Escolha dos ligandos em função das propriedades da molécula a isolar. Isolamento de macromoléculas 22 Imunoafinidade Permite isolamento com base em interacções biológicas (grande especificidade); limite: imaginação do investigador!
12 Reconstituição de proteínas em vesículas lipídicas Recombinação da proteína com lípidos exógenos Dois métodos: a) Co-solubilização da proteína membranar + lípidos em micelas de detergente b) Inserção da proteína em vesículas pré-formadas Co-solubilização da proteína membranar + lípidos em micelas com detergentes Inserção da proteína em vesículas pré-formadas Remoção do detergente por diálise cromatografia Proteína solubilizada em detergente Diluição em suspensão de membranas Diminuição da concentração de detergente << c.m.c. Reconstituição de proteínas em vesículas lipídicas Isolamento e caracterização do sistema reconstituído Gradiente de densidade de sacarose Banda analisada e caracterizada Conteúdo lipídico Quociente lípido:proteína
13 Reconstituição de proteínas em vesículas lipídicas Isolamento e caracterização do sistema reconstituído Função membranar recuperada Proteína reconstituída
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