Aula 8 Proteínas: da extração à estrutura 3D

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1 Introdução a Bioquímica: Biomoléculas Passos necessários para estrutura 3D proteína purificada Aula 8 Proteínas: da extração à estrutura 3D Ignez Caracelli BioMat DF UNESP/Bauru Julio Zukerman Schpector LaCrEMM DQ UFSCar Bauru, 08 de outubro de 2007 Obtenção de proteína purificada extração ISOLAMENTO material de partida extrato bruto desintegração celular extração de enzimas solúveis e de membrana meio de extração? Isolamento células ou tecidos misturar, agitar, homogeneizar, sonicar Sobrenadante com Proteína solúvel proteína purificada células ou tecidos Pellets com células intactas, organelas, membranas e proteínas de membranas

2 extração purificação isolamento PURIFICAÇÃO métodos e condições experimentais estratégia na purificação de enzimas. proteína purificada Separação de Proteínas Coluna cromatográfica Fracionamento: solubilidade da proteína depende da temperatura, ph, forca iônica Diálise Ultrafiltração Coluna cromatográfica Eletroforese reservatório amostra de proteína (fase móvel) m matriz sólida s porosa (fase estacionária) suporte poroso efluente proteínas

3 Cromatografia filtração em gel Cromatografia filtração em gel leito de polímero poroso mistura de proteínas é adicionada à coluna moléculas de proteínas são separadas por tamanho; as moléculas maiores aparecem nas 1 as frações cromatografia por exclusão de tamanho proteínas maiores correm mais rápido volume de amostra é limitado coluna usualmente longa Cromatografia de afinidade Cromatografia de afinidade Separa proteínas por suas especificidades de ligação proteína de interesse ligante mistura de proteínas mistura de proteínas é adicionada à coluna contendo polímeros com ligantes específicos para a proteína de interesse proteínas não-desejadas deixam a coluna solução de ligante proteína de interesse deixa coluna com a solução de ligantes

4 Purificação de uma enzima hipotética Purificação etapa extrato celular bruto precipitação com sulfato de amônio cromatografia de troca iônica cromatografia de gel filtração cromatografia de afinidade volume (ml) proteína total (mg) atividade (unidades) atividade especifica (unidades/mg) fração número n Fraction # A Peaks picos coletor de frações A280 perfil de eluição fração número n Fraction # extração isolamento controle da pureza CONTROLE DA PUREZA Métodos de controle da pureza. Eletroforese purificação QUANTIFICAÇÃO Métodos de quantificação de proteína. ATIVIDADE Ensaios enzimáticos e fatores que governam a atividade catalítica. proteína purificada

5 Eletroforese: SDS-PAGE Eletroforese: SDS-PAGE Amostra catodo poço direção de migração proteínas migram de acordo com tamanho e forma a proteina é denaturada, as subunidades se separam Amostra mistura de macromoléculas anodo direção de migração eletroforese gel poroso Eletroforese: corante Eletroforese: curva de calibração Coomassie blue 4 subunidades

6 Eletroforese: focalização isoelétrica Eletroforese: focalização isoelétrica para determinar pi da proteína utiliza anfolitos para obter um gradiente de ph proteínas param de migrar quando ph = pi Eletroforese: Focalização isoelétrica Eletroforese: Focalização isoelétrica

7 Pontos isoelétricos de algumas proteinas proteína pi pepsina < 1,0 albumina de ovo 4,6 albumina de plasma sangüíneo neo 4,9 urease 5,0 β-lactoglobulina 5,2 hemoglobina 6,8 mioglobina 7,0 quimotripsinogênio nio 9,5 citocromo C 10,7 lisozima 11,0 extração isolamento purificação atividade quantificação controle da pureza proteína purificada IC protocolos e procedimentos no final da purificação M.S.Almeida e E. Kurtenbach, Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, 24, jan/fev, 2002 pool proteína pura ativa concentração ~ 1 mg/ml

8 proteína purificada ativa Métodos típicos para concentração concentração ~ 1 mg/ml baixa quantidade concentração ~ 10 mg/ml ou mais quantidade ~ 30 mg IC.evaporação sob vácuo (cuidado com o tampão!!!).liofilização (cuidado com o tampão!!!!).diálise.filtração.centrifugação (centricon).eletroforese preparativa.retenção em suportes cromatográficos Por que a proteína cristaliza? Métodos para cristalização precipitante PEG sais açúcares solventes orgânicos água Proteína ocorre se o processo for favorável do ponto de vista da termodinâmica os precipitantes removem água do meio forçando as moléculas a se associarem cristalização precipitação solubilidade da macromolécula cula diferem em suas cinéticas

9 Métodos para cristalização DIFUSÃO DE VAPOR lamínula gota (10 µl) (proteína + precipitante) cristalização precipitação difusão de vapor (ca. 60%) processo de equilíbrio entre duas soluções através da fase de vapor em um meio fechado graxa de vácuo solução precipitante (1 ml) MÉTODOS BÁSICOS diálise (ca. 20%) solução inicial menos concentrada (GOTA) difusão em interface livre perde solvente volátil = potenciais químicos batch solução inicial mais concentrada (RESERVATóRIO) DIFUSÃO DE VAPOR lamínula gota (10 µl) (proteína + precipitante) DIFUSÃO DE VAPOR processo de equilíbrio entre duas soluções através da fase de vapor em um meio fechado graxa de vácuo solução precipitante (1 ml) V res >>> V gota equilíbrio atingido pressão de vapor difusão de espécies voláteis gota = reservatório (água ou solvente orgânico) processo de equilíbrio entre duas soluções através da fase de vapor num meio fechado "hanging drop" (gota pendurada) "sitting drop" (gota sentada) "sandwich drop" (gota em sanduíche)

10 Gota tradicional: lisozima Difusão de vapor: Hanging Drop tampão (precipitantes) 30% w / v PEG M NaCl 50 mm AcetatoNa ph 4,5 2µl 2µl 4µl lamínula siliconada lisozima (proteína) 100 mg/ml 50 mm AcetatoNa ph 4,5 largamente usado gota equaliza com o reservatório volume da gota diminui lentamente concentração da solução de proteina aumenta lentamente cristais reservatório [X] gota [Y] A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 B2 B3 B4 B5 B6 C1 C2 C3 C4 C5 C6 D1 D2 D3 D4 D5 D6 Difusão de vapor: Sitting Drop Fases da solução de proteína cristais precipitação metaestável supersaturação reservatório solubilidade subsaturada crescimento e nucleação barreira de nucleação crescimento [Y] [X] A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 B2 B3 B4 B5 B6 C1 C2 C3 C4 C5 C6 D1 D2 D3 D4 D5 D6 [Proteína] solução de proteína

11 Fatores que afetam o crescimento de cristais Experimentos iniciais de cristalização força iônica * íons específicos (Ca 2+ ) concentração da proteina * detergentes Inorganic Precipitant ph* temperatura* tempo monodispersao* vibrações pressão gravidade pureza da proteina* Access to water* ligantes etc... *mais importantes Bioquímica INFORMAÇÕES SOBRE A PROTEÍNA PRECIPITANTES TESTES DE PRECIPITAÇÃO Banco de Cristalização Bancos de dados Cristalização de Proteínas Banco de Cristalização Bioquímica Bancos de dados INFORMAÇÕES SOBRE A PROTEÍNA PRECIPITANTES TESTES DE PRECIPITAÇÃO EXPERIMENTOS INICIAIS DE CRISTALIZAÇÃO

12 Montagem do cristal Coleta de Dados Difração de Raio X reflexões indexadas (h,k,l) lista de intensidades simetria

13 Função densidade eletrônica Mapa de densidade eletrônica o que você vê + o que você pensa = o que você obtém Resultado experimental = o que você vê Resolução

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