FENÓMENOS DE TRANSPORTE. Física Aplicada 2017/19 MICF FFUP

Transcrição

1 FENÓMENOS DE TRANSPORTE ELETROFORESE

2 ELETROFORESE:GENERALIDADES Movimento de partículas num campo elétrico externo Técnica usada para separar e às vezes purificar macromoléculas que diferem na carga, conformação ou tamanho

3 ELETROFORESE:GENERALIDADES Aplicações: Separação de compostos com carga (aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos). Carga dependente do ph do meio. Moléculas negativas e positivas movem-se em direções opostas ao campo elétrico. Determinação da composição das proteínas por comparação com padrões eletroforéticos Alta resolução de separação depende do meio e da partícula

4 ELETROFORESE:PRINCÍPIOS GERAIS Uma partícula de carga Z num campo elétrico E experimenta uma força F Num solvente não condutor: Força elétrica de Coulomb F e qe q == Ze Z = nº de cargas (sem dimensões) e = carga elétrica (1,6022 x10-19 C) E= campo elétrico (volt m -1 )

5 ELETROFORESE:PRINCÍPIOS GERAIS A partícula carregada, no campo elétrico sofre a ação contrária da fricção (ƒ= coeficiente de fricção que é proporcional à velocidade v da partícula no meio Força de fricção: F = fv f ƒ= coeficiente de fricção (Kg s -1 ) v= velocidade de migração

6 ELETROFORESE:PRINCÍPIOS GERAIS No estado estacionário movimento constante F result = 0 = ZE vf Logo ZE = vf v = ZE f

7 MOBILIDADE ELETROFORÉTICA (µ) A mobilidade eletroforética de partículas carregadas num campo elétrico externo e constante, definido como µ A mobilidade eletroforética (μ) é a razão entre a velocidade (v) da macromolécula e o potencial elétrico (E) que move a molécula. Ou, é a razão entre a carga líquida (Z ) e o coeficiente de fricção (f). v = ZE f µ = v = E Z f ( cm 2 / V. sec)

8 PRINCÍPIO TEÓRICO DOS MÉTODOS ELETROFORÉTICOS µ é proporcional à razão z/f Z depende da relação pi da molécula versus ph da solução F = coeficiente de frição depende das condições experimentais Para uma molécula esférica f = 6πrη Então µ = Z 6πrη

9 PRINCÍPIO TEÓRICO DOS MÉTODOS ELETROFORÉTICOS f = 6 π r η = 6 π Rhidrodin η R esfera = 3M V 4 π N A 1/3 D = kt f = RT N A 6 π η R hidrodina Portanto o coeficiente de migração de uma partícula num campo elétrico é dependente Da carga Z e do coeficiente ƒ portanto depende também da Massa molecular M

10 ELETROFORESE DE MACROMOLÉCULAS (PROTEÍNAS) Em condições não desnaturantes, a separação depende da carga (Z) da proteína Dependendo da relação do pi versus ph, a Z proteína pode ser + ou pi ph no qual o somatório das cargas é igual a 0

11 ELETROFORESE DE MACROMOLÉCULAS (PROTEÍNAS)

12 TÉCNICAS Eletroforese livre em solução Em solução, sem suporte sólido Amostra dissolvida em tampão Tubo em U equipado com elétrodos de platina Aplicação da amostra no meio do tubo Refratómetro como detetor Baixa resolução Não aplicável a misturas complexas Só usada para estudos do comportamento das moléculas por ação de um campo eletrico

13 TÉCNICAS Eletroforese em Zonas Usa suportes inertes poliméricos (Papel, amido, gel de agarose, poliacrilamida) Elevada resolução Previne a mistura dos componentes da amostra

14 COMO FUNCIONA

15 ELETROFORESE DE PROTEÍNAS GEL DE POLIACRILAMIDA(PAGE)

16 ELETROFORESE DE PROTEÍNAS GEL DE POLIACRILAMIDA(PAGE)

17 MAS.. molécula carregada rodeada por atmosférica iónica (dificulta a interpretação dos resultados de mobilidade eletroforética) molécula carregada altera o coeficiente de fricção O QUE FAZER para obviar isto??????

18 DESNATURAR A PROTEÍNA COM SDS (SODIUMDODECILSULFATO) A velocidade de migração em campo elétrico depende da dimensão, forma e carga das moléculas Interação da proteína com SDS deixa a proteína com Z total negativa Desnatura a proteína com formação de um complexo SDS: Proteina Z total negativa será proporcional ao tamanho da proteína A ração Z/M será aproximadamente constante (ou f) para proteínas de M diferentes (densidade de carga constante) SDS interage mais com a parte hidrofóbica da proteína

19 AGENTES REDUTORES USADOS

20 ELETROFORESE EM GEL DE PLOACRILAMIDA(SDS- PAGE) SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

21 ELETROFORESE DE PROTEINAS SÉRICAS

22 ELETROFORESE SDS-PAGE: APLICAÇÕES 1. Separar partículas por diferença de Carga e Massa Aplicação de corrente eletrica sobre o gel Isolar DNA, RNA e proteinas Conformação dos ácidos nucleicos ( ácidos nucleicos com igual peso molecular têm diferentes mobilidades eletroforéticas Carga das proteínas Interações macromoleculares Peso molecular das proteínas

23 SDS-PAGE Permite a análise direta de M em função da mobilidade eletroforética Os ácidos nucleicos podem ser separados de acordo com o peso molecular porque possuem uma carga de fosfato por cada base (nucleótido) Para as proteínas o número de cargas depende da composição dos aminoácidos e do ph do tampão O SDS normaliza efeitos devido ao formato da partícula pois desnatura a proteína As cadeias polipeptídicas de determinado comprimento podem adquirir diferentes formas com diferentes coeficientes de fricção (f ) (é proporcional ao seu comprimento

24 DETERMINAÇÃO DO PESO MOLECULAR DE PROTEÍNAS POR ELETROFORESE Não esqueça. Para usar a eletroforese para determinar o peso molecular é necessário Desnaturar as proteínas Introduzir uma carga em cada peptídeo

25 MIGRAÇÃO RELATIVA (R F ) & PESO MOLECULAR (M) R f = migração da molecula desde o ponto de aplicação movimento das moléculas de solvente

26 DETERMINAÇÃO DO PESO MOLECULAR DE PROTEINAS A curva padrão deve ser corrida nas mesmas condições experimentais (mesmo gel preferencialmente) Calibrar com proteínas de peso molecular conhecido

27 Nota: desvios a esta relação ocorrem quando as proteínas se ligam a uma quantidade anormal de SDS (glicoproteínas) ou transportam um número elevado de cargas (histonas)