Cromatografia líquida de alta eficiência

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1 Universidade Federal de Santa Catarina Departamento de Química Cromatografia líquida de alta eficiência Aula de: Michelle Barcellos Professor: Ivan Gonçalves de Souza 1

2 Cromatografia líquida de alta eficiência 2

3 Modalidades e Classificação Líquida Cromatografia Líquida Fase Móvel Cromatografia Gasosa (CG) Gás 3

4 Introdução à cromatografia líquida Vantagens da técnica Versatilidade Sensibilidade Resultados quantitativos Espécies não-voláteis e termolábeis Automatização Limitações da técnica Alto custo do instrumento Alto custo de operação Falta de detector universal sensível Necessidade de experiência no seu manuseio Comparações entre CG e HPLC Fator GC HPLC Requisito p/ amostra Volátil e termicamente estável Solúvel na fase móvel Tipos de amostra Gases, líquido e sólidos Líquidos e sólidos 4

5 Introdução à cromatografia líquida Equipamento de HPLC 5

6 Introdução à cromatografia líquida Instrumentação para HPLC Injetor fase móvelm 6

7 Introdução à cromatografia líquida Instrumentação para HPLC 7

8 Instrumentação para HPLC Fase móvel Reservatório da Fase Móvel 8

9 Instrumentação para HPLC Fase móvel Características da fase móvel Alto grau de pureza ou fácil purificação; Dissolver a amostra sem decompor seus componentes; Não decompor ou dissolver a fase estacionária; Ter baixa viscosidade; Ser compatível com o tipo de detector; Polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da amostra. 9

10 Instrumentação para HPLC Bomba para HPLC Bomba 10

11 Instrumentação para HPLC Bomba para HPLC Sistema de bombeamento REQUISITOS: Vazão contínua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos); Vazões de 0,1 a 10 ml/min Controle de vazão e reprodutibilidade melhor que 1 %; Inércia química: componentes resistente à corrosão. 11

12 Instrumentação para HPLC Inejtor para HPLC Injetor 12

13 Instrumentação para HPLC Inejtor para HPLC Sistema de injeção Loop Loop de 0,5 a 500 µl Reprodutível 13

14 Instrumentação para HPLC Inejtor para HPLC Preenchendo o Loop (Load) 14

15 Instrumentação para HPLC Inejtor para HPLC Injetando no Loop 15

16 Instrumentação para HPLC Colunas para HPLC Coluna 16

17 Instrumentação para HPLC Colunas para HPLC Pré-colunas Pequena e de constituição similar à da coluna analítica Retém: Material particulado Contaminantes do solvente Componentes da amostra que se ligam irreversivelmente à fase estacionária. Custo reduzido 17

18 Instrumentação para HPLC Características das colunas de HPLC Geralmente em aço inox Coluna empacotada Preço: > R$ 1.500,00 18

19 Cromatografia líquida de alta eficiência Tipos de interação soluto/fase estacionária Fase normal Si-OH + R 3 SiCl Si-O-Si-(CH 3 ) 2 R + HCl OH Si silanol livre R = Ciano (-C 2 H 4 CN) Diol (-C 3 H 6 OCH 2 CHOHCH 2 OH) Amina ( C 3 H 6 NH 2 ) 19

20 Cromatografia líquida de alta eficiência Tipos de interação soluto/fase estacionária Fase reversa Fase ligada 20

21 Cromatografia líquida de alta eficiência Tipos de interação soluto/fase estacionária Cromatografia Quiral Separação de isômeros ópticos Fase estacionária: ciclodextrinas, éteres de coroa; Fase móvel: tampões, solventes polares, seletores quirais; 21

22 Cromatografia líquida de alta eficiência Tipos de eluição Separação isocrática ou por gradiente A eluição isocrática éfeita com um único solvente (ou mistura de solventes). Se um solvente não propiciar uma eluição suficientemente rápida de todos os componentes, então pode ser utilizada uma eluição por gradiente. 22

23 Cromatografia líquida de alta eficiência Separação isocrática 23

24 Cromatografia líquida de alta eficiência Separação isocrática 24

25 Cromatografia líquida de alta eficiência Separação isocrática 25

26 Cromatografia líquida de alta eficiência Separação por gradiente Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o gradiente a seguir. 26

27 Cromatografia líquida de alta eficiência Separação por gradiente 30% ACN 40 % MeOH 32% de THF 27

28 Cromatografia líquida de alta eficiência Monógrafo Porcentagem de volume de solvente com mesma força. 28

29 Instrumentação para HPLC Detectores para HPLC Detector 29

30 Instrumentação para HPLC Detectores para HPLC Características ideais para o detector A sensibilidade deve ser compatível com a concentração do analito na amostra. Detector universal Detector seletivo: Permite detectar uma de duas ou mais espécies que coeluam. Em geral, melhor linha base. 30

31 Instrumentação para HPLC Detectores para HPLC Características ideais para o detector Ampla faixa linear: Maior comodidade no dimensionamento do volume de amostra. Analisar em uma mesma corrida cromatográfica espécies de concentrações diferentes. Baixo volume interno Grande volume: Alargamento dos picos registrados. Resposta Rápida Sinal que represente o exato instante de detecção. Detector lento: Picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa. 31

32 Instrumentação para HPLC Detectores para HPLC Detector por espectrofotometria UV-visível 32

33 Instrumentação para HPLC Detectores para HPLC Detector por arranjo de diodos - DAD 33

34 Instrumentação para HPLC Resultado da detecção - Cromatograma Detector por arranjo de diodos - DAD 34

35 Instrumentação para HPLC Resultado da detecção Cromatograma em 3D Detector por arranjo de diodos - DAD 35

36 Referências 1. COLLINS, C.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Fundamentos de Cromatografia. 1ª reimpressão.. Editora da UNICAMP - Campinas: Editora da UNICAMP, SKOOG, D. A., WEST, D. N. Fundamentos de Química Analítica. Barcelona : Reverte, SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A. Principles of instrumental analysis. Philadelphia: Saunders College Publishing, c

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