Exercícios corrigidos 10-17

Transcrição

1 9//20 0- Coluna de exclusão molecular kda Ve Kav log PM , ,38 0,06 2, ,46 0,68 2, ,7 0,353, ,22 0,497,380 Exercícios corrigidos 0-7 V e V Kav= 0 V t V 0 tubos Ve Kav log PM PM 0 0,4 2, ,99 2, ,33, ,5 0,399, b 5 0,428, SDS-PAGE 2.2 total=4.05t kda migration Rf log PM 250 0,2 0,052 2, ,90 0,222 2,70 98,44 0,356, ,05 0,506, ,32 0,573, ,04 0,75, ,82 0,943,204 log PM log PM y=-2,558x+ 2,673 R 2 = Kav y=-,402x+ 2,479 R 2 = Rf -SDS-PAGE- Condições redutoras Tubo migração Rf Log PM PM banda 0, , banda 2 0, , Tubo 2 banda 0,950 0,235 2, banda 2 2,27 0,560, banda 3 3,22 0,795, Tubo3 banda,65 0,407, Tubo 4 banda 2,44 0,602,635 43,52 banda 2 2,94 0,726, banda 3 3, 0,765, SDS-PAGE- Condições não redutoras Tubo 2 migração Rf Log PM PM banda 0,850,287 2, banda 2,00 0,250 2, resultado da cromatografia de exclusão em gel preve um PM maior e portanto deve ser um dímero. Porisso foi realizada a cromatografia de troca iônica que confirma que temos proteína com 2 subunidades ligadas por interações hidrofóbicas no tubo 4A ( PM> 22kDa e PM<22kDa) e uma proteína no 4B (~ 43 kda) A) 7 proteínas B) 29, 20, 4, 34, 80,9, 54,4 e 43.2, kda A proteína de 34 kda apresentava 4 subunidades: 2 de ~ 49.4 e 2 de ~ 23. kda ligadas por pontes dissulfeto e a de 54,4 kda deve ser constituída de duas subunidades ligadas por interações hidrofóbicas C) Proteína do tubo 4A (provavelmente 2 subunidades) tem pi 7 e a proteína do tubo 4B tem pi <7, mas próximo de 7, porque eluiu com baixa concentração de sal 2

2 9//20. Para calcular Km, Vmax - Calcular os valores de /v e /[S] em ausência de inibidor e usar e plotar /v x /[S] y= 0,x + 0, R 2 = Vmax= 0 nmol/min K m = mm - K M Slope=K M Vmax Para calcular Ki ) Calcular os valores de /v e /[S] em presença das diferentes [I] e 2) plotar /v x/[s]. 3-2) Gráficos de duplos recíprocos em presença do inibidor -Pelos gráfico se conclui que se trata de inibição competitivanão altera Vmax mas altera K m /Vmax (inclinação) e, portanto, altera K m. 3) Para calcular -Sem Inibidor a inclinação da reta /v o X /[S] é K M /V max -Com inibidor a inclinação da reta /v o X /[S] é K M /V max X para cada [I], sendo = + [I]/ Portanto Inclinação= Km x = Km x + [I] Vmax Vmax Para [I]= 2 mm a inclinação é: 0,2 = x e = 2mM 4 2

3 9//20 -Alternativamente, pode-se plotar a inclinação do gráfico /v x /[S] para cada concentração do inibidor em função da [I] porque essa inclinação é: Inclinação= Km + Km [I] Vmax Vmax. 0,05= Km Vmax = 2 mm 5 2. Fornecidos os dados cinéticos obtidos com extratos de fígado adulto (E) e fígado embrionário (E2) dizer se os extratos contém a mesma enzima. [S] v o M x0-4 µmol x mg - x min - E E2 K M = 3.x0-4 M E v o K M = 0,5 x 0-4 M E2 S E e E2 são enzimas distintas pois apresentam afinidades (K M ) diferentes pelo mesmo substrato 3

4 9//20 3. Fornecidos os dados cinéticos obtidos com uma amostra de sangue de um paciente inconsciente avaliar se o paciente se exercitou ou sofre de dano hepático. utra informação fornecida foi a de que as enzimas que catalisam a reação no fígado e músculo são isoenzimas (Km da Emúsculo= 0.2 x0-4 M; Km da Efígado (E)= 3 x0-4 M). [S] v o M x0-4 mol x ml de soro - x min - v o K M = 3.x0-4 M Paciente tem problemas no fígado porque a amostra do seu sangue forneceu um K m igual ao da enzima hepática. 7 S 4. Determinar o tipo de inibição por diferentes inibidores a partir de dados cinéticos. v o (nmoles/min) Para determinar o tipo de inibição será necessário fazer o gráfico de /v x /[S] para cada inibidor e analisá-lo. 8 4

5 9//20 -Inibidor I=competitivo (Km/Vm) I(/Vm) V m nmoles/min K m mm µm Km (Substrato)= mm - I + I Km = X Vm = + [I] Ki 003 0,03= K 60 I = 3 x0-6 M - Existe semelhança estrutural entre SeI I. Inibidor aparentemente diminiu a afinidade da E pelo S (aumenta Km aparente) e não altera Vm (altas [S] "vencem" a competição). 9 X= Não competitivo - I + I (Km/Vm) i (/Vm) V nmoles/min m K mm m µm = 5 x0-6 M = 3 x0-6 M Km/Vm + I Vm + I K 0,03= Ki Não existe semelhança estrutural entre S e I. Inibidor não altera K M mas diminui Vm aparente (aparentemente diminui [Et]). = 0 5

6 9//20 Y= Acompetitivo Vm + I = x0-3 M 0,05= Ki Não há semelhança estrutural entre S e I. Inibidor diminui Vm aparente (aparentemente diminui a[et]) [Et]), diminui Km aparente (aparentemente aumenta afinidade E e S) mas não altera a relação Km/Vm (inclinação) Z= Misto Km/Vm + I 0,02= + 0,2 mm 0,20 K I mm 0,80 4,00 00 Vm + I K I Não há semelhança estrutural entre S e I. Inibidor diminui Vm e pode aumentar ou diminuir K M 2 6

7 9//20 5. Nonapeptídeo submetido a vários experimentos para determinar sua estrutura primária. A. Peptídeo + tratamento com DNFB + hidrólise c/hcl conc. + cromatografia indica Ala como aminoácido N-terminal. quimiotripsina B. Peptídeo P P2 P3 Seq/ Ala Arg Pro Glu Ala Gly Phe Ala Phe C. Peptídeo tripsina P P2 Seq/ Ala Phe Ala Gly Phe Ala Arg Pro Glu Comparando os peptídeos obtidos em B e C, chegamos a: Ala Phe Ala Gly Phe Ala Arg-Pro-Glu 3 6. Comparar a migração em cromatografia de papel dos peptídeos Lys-Lys com Leu-Leu-Leu sabendo que o solvente (fase móvel) é butanol: ácido acético:água na proporção de 4::. A relativamente alta proporção de butanol na fase móvel a torna razoavelmente hidrofóbica e portanto deve migrar mais (>Rf) o peptídeo mais hidrofóbico. +H 3 N CH C H N CH C - +NH 3 CH C H N CH C H N CH C - CH CH 3 CH CH 3 CH CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 NH 3 + NH 3 + Lys-Lys Leu-Leu-Leu Compare as estruturas dos peptídeos acima e a resposta fica clara. 4 7

8 9// A. protocolo foi realizado para obter informação sobre o aminoácido N-terminal à medida que o peptídeo e os amino ácidos padrões foram derivatizados i d com dinitrofluorbenzeno, i hidrolisados d em meio ácido e submetidos à cromatografia. B. Pela polaridade dos resíduos podemos inferir que o derivado mais apolar, a Phe (4), vai migrar mais na fase móvel (solvente apolar), em seguida migraria a Gly (3) e o Asp migraria menos (2). 3 C. A mancha inferior corresponde ao Asp-DNF que é o aminoácido N- terminal do dipeptídeo. A mancha superior só pode ser DNF em excesso porque aparece em todas as amostras e é apolar (migra bastante). D. Se omitíssemos esses passos, o dipeptídeo derivatizado não seria hidrolisado e portanto, a mancha inferior migraria diferentemente (não existiria na mistura o Asp-DNF). E. Como os aminoácidos são mais polares que seus derivados DNF, deveríamos utilizar uma fase móvel mais polar e portanto clorofórmio/metanol/ácido ácético 60/30/0 v/v/v, seria a mais adequada. 4 8