Prática 8: Inibição por maltose (Ki) Execução e recolhimento dos exercícios 11 a 13

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1 Prática 7: Caracterização da -glicosidase (Km e Vmax) Prática 8: Inibição por maltose (Ki) Execução e recolhimento dos exercícios 11 a 13 Prática 7: Caracterização da -glicosidase (Km e Vmax) Prática 8: Inibição por maltose (Ki) Objetivos: Cinética Enzimática e Inibição da Atividade Enzimática 1. Estudar o efeito da [S] na velocidade da reação da -glicosidase contida no lisado de Saccharomyces cerevisiae. CH 2OH O O NO 2 -glicosidase Abs em 420 nm em meio alcalino Glicose + HO NO 2 p-nitro-fenol 2. Repetir o experimento 1 na presença de duas concentrações de um inibidor (maltose). CH 2OH O O CH 2OH O Cuidados com as concentrações das soluções e com os volumes pipetados!!! 1

2 Cinética Enzimática Ferramenta para a compreensão do mecanismo de ação de enzimas Qual o principal parâmetro avaliado em uma cinética enzimática??? VELOCIDADE da REAÇÃO Cinética enzimática estuda a velocidade da reação enzimática e como ela se altera em função de mudanças nos parâmetros experimentais O primeiro passo é determinar a VELOCIDADE INICIAL (V 0 ) Inclinação = P/ t = V 0 2

3 Velocidade da reação de muitas enzimas varia em funçao da concentração de substrato, [S], segundo uma hipérbole (semelhante à curva de saturação de O 2 da mioglobina) V 0 Vmáx [S]>>>Km Ordem zero em relação ao substrato Mantendo-se a [E] fixa e aumentando [S]: Mista [S]<<<Km Primeira ordem em relação ao substrato S E ES [S] Como explicar esse comportamento matematicamente?? k 1 E + S ES E + P k -1 k 2 k -2 Passo determinante da velocidade 3

4 Dedução da Equação de Michaelis & Mentem Pág. 196, Lenhinger, 5 ed. V o : velocidade no tempo inicial quando a [S] >>> [E] V max : V máximo [S]: concentração do substrato K m : constante de Michaelis Simplificações para a dedução da Equação de Michaelis & Mentem 1. Com relação às velocidade de formação e quebra do complexo ES - E + S ES: a etapa de formação do complexo é reversível e relativamente rápida - ES E + P: a etapa de quebra do complexo ES é LENTA!(etapa determinante da velocidade da reação) 2. Com relação à concentração de E, S, ES e P. k 1 E + S ES E + P k -1 k 2 k -2 - A enzima pode existir em duas formas, livre ou complexada ao substrato. Portanto: [E Total ]=[E Livre ]+[ES] - Normalmente [S]>>>[E Total ], portanto a quantidade de S ligada à enzima é insignificante: [S Livre ]=[S Total ] - Para baixo consumo de S (menos que 5 %) a [P] (produto) é muito baixa. Assim, as etapas reversas a partir de P podem ser ignoradas (k -2 pode ser ignorado!) - Com exceção à fase inicial da reação (estado pré-estacionário, alguns microsegundos após a mistura de E+S), a [ES] se mantém constante até que todo o substrato seja consumido (estado estacionário). No estado estacionário, a velocidade de formação de ES deve ser igual à velocidade de quebra de ES. 4

5 Quando a enzima é misturada com um grande excesso de substrato, há um período inicial chamado de pré-estacionário em que a concentração de ES aumenta. Normalmente este período é muito curto (microsegundos) e a reação atinge um estado chamado de ESTADO ESTACIONÁRIO no qual [ES] permanece constante ao longo do tempo. A determinação de v o (velocidade inicial) reflete esse estado estacionário. A análise de v o é denominada Cinética do Estado Estacionário. Cinética do Estado Estacionário é a base para a dedução da equação de Michaelis e Menten Dedução da Equação de Michaelis & Mentem Pág. 196, Lenhinger, 5 ed. 5

6 Velocidade varia proporcionalmente com a concentração de enzima. Em qualquer concentração de S, v 0 =c[e] (dobrando-se E, dobra-se v 0 ) V 0 2[E] [E] 0.5[E] [S] Equação de Michaelis-Menten k 1 E + S ES E + P k -1 k 2 [S] <<< Km [S] >>>Km V 0 = Vmax [S] Km V 0 = Vmax (Reação de 1ª ordem em S) (Reação de ordem Zero em S) v max = k 2 [E Total ] No Vmax toda a enzima está saturada com S. Portanto [E Total ]=[ES] V 0 = Vmax 2 Vmax = Vmax[S] 2 Km + [S] Km=[S] Km= k -1 + k 2 k 1 Se k 2 muito pequeno: Km= k -1 = K ES k 1 Somente quando k2 muito pequeno o valor de Km indica a afinidade da enzima pelo substrato K ES ou Ks = constante de dissociação de ES 6

7 LINEARIZAÇÃO da Equação de Michaelis-Menten para determinação de Km e Vmax V o : velocidade no tempo inicial quando a [S] >>> [E] V max : V máximo [S]: concentração do substrato K m : constante de Michaelis Transformação da equação de Michaelis e Mentem Gráficodo Duplo-Recíproco (Equaçãode Lineweaver- Burk) y = a x + b K m (unidade: Molar, mm, M, etc.) K M = [S] quando v o = 1/2 Vmax. Em geral, quanto menor o K M, mais forte é ligação do substrato pela enzima. K M é usado como uma medida da afinidade da enzima pelo substrato Lembrar que: Km= k -1 + k 2 k 1 Portanto, somente quando k 2 muito pequeno: Km= k -1 = K ES k 1 7

8 k cat (S -1 ) Turnover Number (número de renovação) N o de moléculas de substrato convertidos em produto em uma unidade de tempo por uma única enzima saturada com o substrato. kcat = k da etapa limitante kcat = k quando a enzima está saturada com substrato kcat = velocidade máxima de conversão de substrato kcat = Vmax/[E]t Obs.: kcat não é a melhor maneira de comparar a eficiência catalítica pois essas constantes são válidas para concentrações saturantes de substrato (não fisiológica). Em geral as enzimas trabalham em condições não saturantes de substrato (importante para a regulação) k cat /Km (M -1 S -1 ) (Constante de Especificidade) Medida da Eficiência Catalítica ( Perfeição Catalítica ) Quando S<<Km: Quanto maior o valor melhor é a eficiência catalítica da enzima Kcat/Km: É uma medida do quão rápido 2 moléculas (E + S) podem reagir. Existe um limite máximo para esta constante que é determinada pelo limite de difusão max Enzimas com kcat/km>10 8 diz-se que a enzima atingiu a perfeição catalítica. 8

9 INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Enzimas estão sujeitas à inibição 1. Importância Farmacêutica do estudo da inibição enzimática Inibidores enzimáticos são agentes moleculares que interferem na catálise, diminuindo ou acelerando a velocidade da reação esse é o mecanismo de ação da grande maioria de agentes farmacêuticos. 2. Classificação: 1) Inibição Reversível: Inibição Competitiva Inibição Acompetitiva Inibicação Não-Competitiva Inibição Mista 2) Inibição Irreversível 9

10 Medicamentos que são inibidores de enzimas: -Viagra (sildenafil), Pfizer -Cialis, Eli Lily -Levitra, Bayer e Glaxo-Smith Inibidores da Fosfodiesterase (PDE5) [Ca 2+ ] Relaxamento da células musculares lisas Medicamentos que são inibidores de enzimas: Anti-inflamatórios não-esteroidais: -Vioxx, Merck (tirado do mercado em 2004 devido a incidência de problemas cardiovasculares; causando a morte de app pessoas no mundo) -Celebra, Pfizer Inibidores específicos da COX-2 Rofecoxib (Vioxx) Celecoxib (Celebra) Fonte: 10

11 Medicamentos que são inibidores de enzimas: Inibidores da síntese do colesterol: -Estatinas Inibidores da HMG-CoA Redutase Atorvastatin (Liptor) Lovastatin (Mevacor) Fonte: Science 11 May 2001: Vol. 292 no pp DOI: /science Enzimas estão sujeitas à inibição 1. Importância Farmacêutica do estudo da inibição enzimática Inibidores enzimáticos são agentes moleculares que interferem na catálise, diminuindo ou acelerando a velocidade da reação esse é o mecanismo de ação da grande maioria de agentes farmacêuticos. 2. Classificação: 1) Inibição Reversível: Inibição Competitiva Inibição Acompetitiva Inibicação Não-Competitiva Inibição Mista 2) Inibição Irreversível 11

12 Inibição Competitiva Inibição Não-Competitiva [E][I] Ki = K EI = [EI] Inibidorse liga no mesmo sítio ativo que o substrato Ki=Ki K EI =K ESI Inibição Acompetitiva Sítios diferentes de ligação Inibição Mista [ES][I] Ki = K ESI = [ESI] reação para Inibidor liga-se a enzima em um sítio diferente a do sítio ativo do substrato. Ki Ki K EI K ESI Ki: constante de dissociação do inibidor Qto < Ki, mais potente é a inibição. Inibição competitiva Ex.: Metanol/Etanol (Semelhança estrutural!) Vo = Vmax [S] Km + [S] = 1 + [I] Ki Ki=K EI Inibidor compete com o substrato pelo sítio ativo e portanto o aumento da concentração do substrato pode deslocar o inibidor. Portanto Vmax não se altera. Assim em concentrações crescentes de [I]: 1. Vmax não se altera 2. Km aparente aumenta 3. Slope aumenta 12

13 Inibição Acompetitiva Vo = Vmax [S] Km + [S] = 1 + [I] Ki Ki =K ESI Inibidor se liga-se ao complexo ES, em um sítio diferente a do sítio ativo do substrato. Portanto um aumento na [S] não reverte a inibição. A ligação do inibidor remove uma fração de ES. I diminui Vmax aparente (aparentemente diminui [Et]) e Km aparente (aparentemente aumenta a afinidade de E e S) Assim em concentrações crescentes de [I]: 1. Vmax aparente diminui 2. Km aparente diminui 3. Slope não altera Inibição Mista Vo = Vmax [S] Km + [S] = 1 + [I] Ki = 1 + [I] Ki Ki Ki` K EI K ESI Inibidor liga-se a um sítio diferente do sítio ativo, bloqueando tanto E como ES. Portanto afeta tanto o Km como Vmax. Assim em concentrações crescentes de [I]: 1. Vmax aparente diminui 2. Km aparente aumenta ou diminui 3. Slope aumenta ou diminui 13

14 Inibição Não-competitiva = 1 + [I] Ki Ki=Ki` K EI =K ESI Vo = Vmax [S] Km + [S] = 1 + [I] Ki Inibidor liga-se a um sítio diferente do sítio ativo, bloqueando tanto E como ES. Portanto afeta tanto o Km como Vmax. Assim em concentrações crescentes de [I]: 1. Vmax aparente diminui 2. Km aparente não altera 3. Slope aumenta Determinação do Ki Slope ou Km Competitivo Slope ou 1/Vmax Mista -Ki [I] -Ki ou -K EI (se y =inclinação) -Ki ou -K ESI (se y =slope) [I] 1/Vmax Acompetitivo Slope ou 1/Vmax Não competitiva -Ki [I] -Ki = - K EI =-K ESI [I] 14

15 Inibição Irreversível Inibidores irreversíveis combinam-se com um grupo funcional na molécula da enzima ou o destroem ou ainda formam uma associação covalente bastante estável. (INATIVADOR SUICIDA) Cinética de inibição similar ao inibidor não-competitivo (Vmáx diminui, Km não se altera). O Inibidor diminui a concentração efetiva de enzima livre. São úteis como ferramentas no estudo de mecanismo de reação, principalmente para a identificação de aminoácidos importantes para a catálise no sítio ativo. Diisopropylfluorophosphate Forma permanentemente inativa Quimotripsina 15