Actividade ou v 0 ou v inicial =k cat [E S] v inicial = k cat [E S] = Vmax. v inicial = k cat [Etotal]/2 v inicial = Vmax/2. k cat

Transcrição

1 Numa reacção enzímica existe um ciclo catalítico em que da ligação entre a enzima lire e o resulta a formação do complexo E S; o complexo E S pode dissociar-se mas também ai formando produto e regenerando enzima lire. Num ensaio enzímico enquanto a concentração de não baixar de forma significatia a concentração do complexo E S ai-se mantendo numa concentração estacionária. O alor da concentração estacionária de E S depende (1) da concentração de enzima, (2) da concentração de e k cat A elocidade de formação do produto é proporcional à concentração do complexo E S k cat [E S] Actiidade ou ou k cat [E S] k cat [Etotal]/2 /2 Se não há [E S] inicial Existe uma concentração de ( Km) em que metade das moléculas de (enzima hemisaturada) [E S] [E] [E S] [Etotal]/2 concentração de Km Se a concentração de é eleada quase todas as moléculas de [E S] [Etotal] k cat [Etotal] concentração de é saturante (3) da afinidade entre a enzima e o seu Se [S] < K m é quase proporcional a [S]...e menos de metade das moléculas de A actiidade enzímica para concentração saturante de... se a concentração de é eleada ariações moderadas na concentração do não afectam a actiidade para dosear enzimas é frequente usarem-se concentrações eleadas de porque o gráfico produto formado ersus tempo se mantém linear durante mais tempo. Se [S] K m / 2...e a enzima está hemisaturada 23 A partir da equação...pode deduzir-se o alor de para determinadas concentrações de. Km >> [S]... se Km>>[S] denominador Km [S] Km Km << [S] [ S] +... se Km<<[S] denominador [S] S [ ] 2 Km é directamente proporcional a [S] para baixas concentrações de S... se Km[S] denominador 2 [S] 2 não é afectado por 24[S] para altas concentrações de S

2 O Km é uma medida da afinidade da enzima para o seu...quando maior o alor do Km menor a afinidade e ie-ersa. O Km mede a afinidade da enzima para o seu 12...quando maior o alor do Km menor a afinidade. (mm) A enzima azul precisa de uma concentração de menor para ficar hemisaturada......porque tem maior afinidade para o que a enzima cinzenta. Em ambos os casos a enzima está hemisaturada Km < Km 25 A enzima azul já está hemisaturada ([E S][Et]/2) quando [S] 3 mm (Km 3 mm) tem alta afinidade para o A enzima ermelha está hemisaturada ([E S][Et]/2) quando [S] 1 mm (Km 1 mm) tem baixa afinidade para o 26 Estudar o alor do K m sere para caracterizar uma enzima mas também pode serir para compreender a sua regulação in io. 1- Duas isoenzimas podem distinguir-se por alores distintos no K m do (caso da hexocínase muscular e glicocínase hepática...). hexocínase muscular glicocínase hepática Em alguns casos foi possíel estudar in io a ariação da actiidade de enzimas com a concentração do. Num estudo de Brindle et al. (1989) estimulou-se electricamente o nero ciático de ratos e mediu-se, na musculatura da perna, por NMR (1) a concentração de ADP e (2) a incorporação de Pi no ATP (síntase do ATP). Alta actiidade contráctil Se o alor das concentrações fisiológicas do (in io; na célula) é conhecida, a comparação com o alor do K m Baixa actiidade contráctil...pode serir para estimar o efeito das ariações fisiológicas da concentração do 27 na actiidade da enzima. Brindle et al. (1989) Biochemistry 28:

3 Quando se estuda o efeito da concentração de na actiidade de algumas enzimas e se representa ersus [S] o gráfico pode ser não uma hipérbole mas um sigmóide. As teorias actualmente mais aceites para interpretar este tipo de comportamento cinético surgiram na década de 6 e isaam interpretar um fenómeno semelhante: a forma sigmoide do gráfico de saturação da hemoglobina. Essas teorias reelaram-se adequadas para interpretar as cinéticas de tipo sigmoide em enzimas com mais de um local de ligação ao por molécula de enzima (enzimas poliméricas). 29 A actiidade das enzimas pode ser diminuída ou aumentada pela adição ao sistema de ensaio de modificadores da actiidade enzímica (inibidores e actiadores). Adicionando a um meio de ensaio uma substância M (inibidor ou actiador) e mantendo constantes todas as outras condições de ensaio podemos obter diminuição (inibição) ou aumento (actiação) da actiidade enzímica. na ausência de inibidor 1 UI 3 UI Grau de inibição 3% Actiidade enzímica Grau de inibição ou grau de actiação inicial } o +inibidor o{ inicial na ausência de M +actiador 3 Um estudo mais aprofundado do efeito de um inibidor na actiidade duma enzima pode reelar que ele aumenta o K m do sem modificar. Quando se estuda a actiidade enzímica para ários alores de [S] podemos, multiplicando o número de tubos de ensaios, fazer esse estudo: na ausência e na presença de um inibidor I. Para explicar o comportamento deste sistema (I aumento do K m mas I não afecta ) poderemos admitir que o inibidor I e o S se ligam no centro actio da enzima competindo entre si. Algumas ezes obsera-se que: 1- Na presença do inibidor o alor de não se modifica; para concentrações de eleadas o inibidor I não tem efeito. O alor do K m obserado é maior na presença de I que na sua ausência; o grau de inibição é mais marcado para concentrações de baixas. Nestes casos falamos de inibição competitia Para [S] 4 grau inibição 5% 31 As possibilidades do modelo apresentado corresponder à realidade são reforçadas se as estruturas moleculares do e do inibidor forem semelhantes. O malonato compete com o succinato na 32 actiidade da desidrogénase do succinato

4 Um inibidor competitio aumenta o Km do com o qual compete se o inibidor está presente, para obter hemisaturação da enzima com, preciso de ter maior concentração do. O anadato é um inibidor competitio da fosfátase alcalina. sem anadato /2 anadato 2,5 µm Na ausência de inibidor esta concentração de permitia hemisaturação. O Km era 9. Mas na presença do inibidor para esta concentração de só 1/6 das moléculas de. Na presença do inibidor competitio preciso de aumentar a concentração de para 32 para obter hemisaturação com o. Na presença do inibidor 33 o Km (que era 9) aumentou para 32. Km (sem anadato) 1,1 mm Km (com anadato) 7,6 mm Seargeant & Stinson (1979) Biochem J. 181: 247. O anadato (HO 4 ) se adicionado a meios de ensaio que contenham paranitrofenilfosfato e fosfátase alcalina inibe a actiidade da enzima. 34 A inibição é de tipo competitio. H 2 O Quando se estuda de efeito de um inibidor para diferentes concentrações de podemos, eentualmente, obserar que a inibição não é de tipo competitio. Algumas ezes obsera-se que: A fosfátase alcalina catalisa a hidrólise do para-nitrofenilfosfato: para-nitrofenilfosfato + H 2 O para-nitrofenol + HPO 4 O anadato (HO 4 ) é um análogo estrutural do fosfato inorgânico (contém anádio em ez de fósforo). O fosfato é um produto da reacção e um dos resíduos do. O anadato (tal como o fosfato inorgânico) é um inibidor da fosfátase alcalina porque se liga no centro actio da enzima impedindo a ligação do. A ligação entre o anadato e a enzima não é de tipo coalente: o anadato liga-se à enzima por interacções de tipo electrostático e as formas ligada e desligada da enzima encontram-se em equilíbrio. Se se aumentar a concentração de mantendo a concentração de anadato a probabilidade de uma molécula de enzima se ligar ao aumenta enquanto a probabilidade de se ligar ao anadato diminui. No limite, para muito altas concentrações de o anadato deixa de ter efeito inibidor. O anadato é um inibidor competitio da fosfátase alcalina porque compete com o paranitrofenilfosfato para sua ligação à 35 enzima. 1- O é menor na presença de I que na sua ausência. Na presença de I o K m não se modifica; a concentração de para a qual se obsera um alor de actiidade que é metade de (ou de ) é igual na presença e na ausência de I. 3-O grau de inibição é independente da concentração de. No exemplo o grau de inibição 4% para todas as concentrações de Nestes casos diz-se que a inibição é não competitia. 36

5 Um modelo possíel para explicar a inibição de tipo não competitio é admitir a existência na enzima de um local de ligação diferente do centro actio cuja ligação ao inibidor impedisse a formação do produto. A par da classificação que diide os inibidores em competitios e não competitios existe uma outra que diide os modificadores (inibidores ou actiadores) em isostéricos ou alostéricos. Um modificador isostérico liga-se ao centro actio e é sempre inibidor: é um inibidor isostérico. Um ligando alostérico liga-se à enzima num sítio diferente do centro actio (um sítio alostérico) proocando uma alteração conformacional na enzima. Sítios alostéricos Inibidor alostérico Se a alteração conformacional diminuir a actiidade da enzima dizemos que há inibição alostérica. De acordo com este modelo tudo se passaria como se as moléculas de enzima ligadas ao inibidor estiessem excluídas do processo catalítico, isto é, a concentração de enzima tiesse baixado. 37 Actiador alostérico Se a alteração conformacional aumentar a actiidade da enzima dizemos que há actiação 38 alostérica. Quando uma fibra muscular se contrai aumenta a elocidade de hidrólise do ATP e aumenta a concentração de ADP (e AMP; 2 ADP AMP + ATP). O AMP liga-se à fosforílase muscular induzindo uma conformação mais actia o AMP é um actiador alostérico da fosforílase muscular. Fosforílase muscular na conformação tensa (inactia) AMP sítio alostérico Fosforílase muscular na conformação relaxada (actia) A cínase-1 da frutose-6-p (ATP+ Frutose-6-P ADP + Frutose-1,6-bisfosfato) o ATP é, simultaneamente, e inibidor alostérico. Para concentrações fisiológicas de ATP, o AMP é um actiador alostérico. (3) O AMP compete com o ATP pelo mesmo sítio alostérico impedindo a sua acção inibidora. AMP centro actio 39 (1) Um dos s da cínase da frutose-6-p é o ATP. (2) Contudo, existe na enzima um sítio alostérico onde o ATP se liga inibindo-a. Para concentrações fisiológicas de ATP essa acção inibidora é muito 4 marcada.