Enzimas Fonte: Wilson & Walker. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology, 7ed. Página 581-

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1 Degustação de trechos de livros sugeridos Enzimas Fonte: Wilson & Walker. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology, 7ed. Página 58- Quando uma enzima é misturada com um excesso de substrato há um período de tempo inicial curto (algumas centenas de microsegundos) em que os intermediários levando a formação do produto aumentam gradativamente (Figura 5. pág 585 do livro). Esta etapa chamada de estado pré-estacionário requer técnicas especiais para o estudo os quais serão discutidos na Seção Após o estado pré-estacionário, a velocidade da reação e a concentração dos intermediários alteram-se relativamente de forma lenta com o tempo constituindo a chamada cinética do estado estacionário. Medidas do progresso da reação durante esta fase resultam na relação mostrada na Figura 5.2. As tangentes desenhadas a partir da origem das curvas de concentração de substrato (S) e de produto (P) versus o tempo permitem calcular a velocidade inicial ( o ). Esta é a velocidade máxima para uma determinada concentração de enzima e substrato sob as condições experimentais definidas. Medidas da velocidade inicial de uma reação catalisada enzimaticamente são essenciais para o completo entendimento do mecanismo de ação da enzima, bem como para a estimativa da atividade de uma enzima em uma amostra biológica. Seu valor numérico é influenciado por vários fatores, incluindo concentração de substrato e enzima, ph, temperatura e a presença de ativadores ou inibidores. Para várias enzimas, a velocidade inicial, o, varia hiperbolicamente com a concentração do substrato para uma concentração fixa de enzima (Figura 5.3). A equação matemática que expressa essa relação hiperbólica entre velocidade inicial e a concentração de substrato é conhecida como equação de Michaelis-Menten: o = V max [S] K m + [S] Onde V max é o valor máximo da velocidade inicial quando todos os sítios ativos estão ocupados, K m é a constante de Michaelis e [S] é a concentração do substrato. Em baixas concentrações do substrato a ocupação dos sítios ativos das enzimas é baixa e a velocidade da reação é diretamente relacionada ao número de sítios ocupados. Isto é, próxima da cinética de primeira-ordem em que a velocidade é proporcional à concentração do substrato. Em concentrações altas do substrato, todos os sítios ativos são ocupados e a reação torna-se independente da concentração do substrato, pois não há como formar mais complexos enzima-substrato (ES), observando-se assim uma cinética de ordem-zero ou de saturação em relação ao substrato. Sob estas condições a velocidade da reação é somente dependente da conversão do complexo enzimasubstrato, ES, em produto (P) e da difusão dos produtos a partir da enzima. Pode ser observado a partir da equação 5. que quando o =0.5 V max, K m =[S]. Então, K m é numericamente igual à concentração do substrato quando a velocidade inicial é igual à metade da sua velocidade máxima (Figura 5.3) tendo como unidade a molaridade. Valores de K m estão na faixa de 0-2 a 0-5 M e são importantes pois permitem calcular a concentração do substrato necessária para saturar todos os sítios ativos da enzima. Quando a [S]>>Km, a equação 5. é reduzida a o V max, mas um simples cálculo revela que quando [S] = 0 Vmax, o é somente 90% V max e que quando

2 2 [S] = 00 K m, o =99 % V max. Apreciações deste tipo são importantes para os ensaios enzimáticos. Como mencionado anteriormente, reações catalisadas enzimaticamente ocorrem por meio da formação de um complexo enzima-substrato em que o substrato (S) liga-se nãocovalentemente ao sítio ativo da enzima (E). A formação deste complexo para a maioria das enzimas é rápido e reversível e é caracterizado por uma constante de dissociação, K s do complexo: Onde k e k - são as constantes de velocidade para as reações de formação e dissociação do complexo ES, respectivamente. No equilíbrio, as velocidades de formação e dissociação são iguais e a lei de ação das massas pode ser aplicada para a reação reversível: k [E][S] = k - [ES] Portanto, K s = [E][S] = k - = [ES] k K a Onde K a é a constante de associação (ou afinidade). Pode ser observado que quando o K s é numericamente grande, o equilíbrio está a favor das formas E e S livres. Por outro lado, quando o K s é numericamente pequeno, o equilíbrio está a favor da formação do complexo ES. Portanto, K s é inversamente proporcional à afinidade da enzima pelo substrato. A conversão de ES em produto (P) pode ser representada pela equação: Onde k 2 é uma constante de primeira ordem para a reação. Em alguns casos a conversão de ES em E e P pode envolver vários estágios e pode não ser essencialmente irreversível. A constante de velocidade k 2 é geralmente menor que k e k -, e em alguns casos muito menor. Em geral, portanto, a conversão e ES em produtos é a etapa limitante tal que a concentração de ES é essencialmente constante, mas não necessariamente a concentração de equilíbrio. Nestas condições a constante de Michaelis, K m, é dada por: K m = k 2 + k - = K s + k 2 k k É evidente, que nestas circunstâncias, K m deve ser numericamente maior que K s e somente quando k 2 é muito pequeno o K m se aproxima do valor de K s. A relação entre 2

3 3 estas duas constantes torna-se mais complicada pelo fato de que para algumas reações enzimáticas dois produtos (P e P2) são gerados sequencialmente, cada um deles controlado por constantes de velocidade diferentes. Portanto, cuidados devem ser tomados na interpretação do significado de K m em relação ao K s. A relação matemática entre K m e K s e K m e afinidade da enzima pelo substrato só pode ser apreciada totalmente somente quando o mecanismo completo da reação é conhecido. Embora a equação de Michaelis e Mentem possa ser usada para o cálculo de V max e K m, seu uso é sujeito a dificuldades na determinação experimental de o em altas concentrações de substrato, em outras palavras, na extrapolação da curva hiperbólica para obtenção de um valor exato de V max. Transformações lineares da equação de Michaelis e Mentem são alternativas comumente utilizadas. O mais popular destes é a equação de Lineweaver-Burk obtida tomando-se o recíproco da equação de Michaelis e Mentem. = K m + o V max [S] V max O gráfico de / o (y) versus /[S] (x) resulta em uma reta, onde a inclinação é K m /V max, o intercepto no eixo / o é igual a /V max e o intercepto no eixo /[S] é igual a -/K m. Gráficos alternativos são baseados na equação de Hanes e na de Eadie-Hofstee. Também existem softwares de regressão não linear como o DynaFit ( e BRENDA ( os quais são utilizados preferencialmente em casos onde se requer dados precisos de cinética. É importante notar que enquanto o K m é uma característica da enzima e de seu substrato e o seu valor independente da quantidade da enzima utilizada para a sua determinação experimental, o mesmo não é verdade para o V max. Não existe um valor absoluto de V max e o seu valor depende da quantidade de enzima usada. Essa característica é ilustrada na Figura 5.3 (página 586) e é adicionalmente discutida no Exemplo (página 589). Além de K m e V max, uma outra constante catalítica de importância é k cat, ou número de renovação (turnover number), definido como: k cat = Vmax [Et] Onde [Et] é a concentração total de enzima. O número de renovação é o número máximo de mols de substrato que podem ser convertidos em produto por mol de enzima em uma unidade de tempo. Sua unidade é dada pelo recíproco do tempo em segundos (s - ). Seus valores variam de a 0 7 s -. Catalase possui um número de renovação de s - e é uma das enzimas mais eficientes conhecidas. O potencial catalítico de um alto valor de número de renovação só pode ser atingido em altas concentrações de substrato (concentrações saturantes) e isso é raramente atingida em condições celulares. Uma constante alternativa, chamada de constante de especificidade, definida como k cat /K m, é uma medida de quão eficientemente uma enzima converte substrato em produto em baixas concentrações de substrato. Sua unidade é dada por M - s -. Para um substrato ser convertido em produto, moléculas de substrato e da enzima precisam primeiramente colidir por difusão randômica e então combinar-se e uma orientação correta. Difusão e colisão possuem constantes de velocidades teóricas 3

4 4 limitantes em torno de 0 9 M - s - e várias enzimas, incluindo acetilcolina esterase, anidrase carbônica, catalase, -lactamase e triosefosfato isomerase, possuem constantes de especificidade próximas deste valor indicando que elas estão próximas ao máximo de eficiência catalítica. Como a constante de especificidade é uma razão entre duas outras constantes, enzimas com constantes de especificidade similares possuem valores bastante diferentes de K m. Como exemplo, catalase possui constante de especificidade de M - s - com um K m de. M (bastante alto), por outro lado, fumerase possui uma constante de especificidade de M - s - com um K m de M (bem baixo). Complexos multienzimáticos conseguem superar limitações decorrentes de difusão e colisão. Neste caso, o produto de uma reação é passada diretamente por um processo de direcionamento (channelling) para o sítio ativo da próxima enzima na via como consequência da justaposição no complexo, portanto eliminando limitações referentes à difusão. Efeito da concentração do substrato Pode ser observado para reações enzimáticas monosubstrato que eles obedecem a cinética de Michaelis e Mentem: o = k 2 [E][S] K m + [S] E, portanto, o = k 2 [E] (K m /[S]) + Então, quando a concentração do substrato é grande, a equação anterior reduz-se a o = k 2 [E] Onde a velocidade é proporcional à concentração do susbstrato. Esta é a base para determinação experimental da atividade enzimática de uma amostra biológica. 4

5 5 Inibição de reações enzimáticas - Inibição reversível competitiva Inibidores reversíveis combinam-se não covalentemente com as enzimas e, portanto podem ser removidas facilmente por diálise. Inibidores reversíveis competitivos combinam-se no mesmo sítio que o substrato e deve ser, portanto ser relacionado estruturalmente com o substrato. Como exemplo pode-se citar a inibição da succinato desidrogenase por malonato: CH 2 COOH CH 2 COOH Ácido succínico (Substrato) Succinato desidrogenase CHCOOH CHCOOH Ácido fumárico (Produto) CH 2 COOH COOH Ácido malônico (Inibidor) Succinato desidrogenase Nenhuma reação Todos os inibidores reversíveis são caracterizados por uma constante de dissociação,, chamada de constante de inibição, que pode estar relacionada com a constante de dissociação de EI (K EI ) ou de ESI (K ESI ). Para inibidores competitivos as duas equações seguintes pode ser escritas como: E + S ES E + P E + I EI sem reação Como a ligação do substrato e do inibidor ocorrem no mesmo sítio, o efeito do inibidor pode ser desfeito aumentando-se a concentração do substrato. O resultado é que o V max não se altera, mas a concentração necessária para atingir o V max é aumentada de forma que quando o = 0.5 Vmax: [S] = K m + [I] Onde a [I] é a concentração do inibidor. Pode ser observado pela equação acima que é igual à concentração do inibidor que aparentemente dobra o valor de K m. Com este tipo de inibidor, é igual a K EI, enquanto K ESI é infinito pois ESI não é formado. Na presença de inibidor competitivo, a equação de Lineaweaver-Burk torna-se: 0 K m = Vmax [S] + [I] + V max Aplicação desta equação permite o diagnóstico de inibição competitiva (Figura 5.5a, página 593). O valor numérico de pode ser calculado a partir do gráfico de Lineaweaver-Burk para a reação sem o inibidor e com o inibidor. Na prática, no 5

6 6 entanto, valore mais preciso é obtido através de um segundo gráfico (Figura 5.6, página 593). A reação é conduzida para várias concentrações do substrato na presença de algumas concentrações de inibidor, e em seguida constrói-se um gráfico de Lineawever-Burk para cada concentração do inibidor. Um segundo gráfico é construído plotando-se os diferentes valores de inclinação ou de K m aparente [K m, que é igual a K m (+ [I]/ ) e que pode ser determinado através do intercepto no eixo /[S] ] versus concentração do inibidor. Em ambos os gráficos o intercepto no eixo de [I] dá o valor de. -Inibidor reversível não-competitivo Um inibidor reversível não-competitivo combina-se com a enzima em um sítio diferente do sítio ativo do substrato. Por mais que o substrato ainda possa se ligar ao complexo EI formando um complexo ternário ESI, este complexo não é capaz de converter substrato em produto e é chamado de complexo final suicida. Como a inibição envolve um sítio distinto do sítio catalítico, a inibição não pode ser revertida pelo aumento da concentração do substrato. A consequência é que V max e não o K m é reduzido, pois o inibidor não afeta a ligação do substrato à enzima, mas afeta a quantidade de ES que pode prosseguir em direção à formação do produto. Neste tipo de inibição K EI e K ESI são idênticos e é numericamente igual a ambos. Neste caso a equação de Lineaweaver- Burk torna-se: 0 K m = Vmax [S] + V max + [I] Uma vez que inibidores não-competitivos tenham sido diagnosticados, o valor de é melhor determinado através de um segundo gráfico obtido plotando-se os diferentes valores de inclinação ou de /V max (intercepto no eixo / o ) versus concentração de inibidor ([I]). Em ambos os gráficos o intercepto no eixo de [I] dá o valor de. - Inibidor reversível acompetitivo Um inibidor reversível acompetitivo pode-se ligar somente ao complexo ES e não à enzima livre e, portanto o inibidor se liga a um sitio que é criado durante a alteração conformacional da enzima promovida pela ligação ao substrato. O complexo ternário, ESI, resultante é chamado de complexo final suicida. Assim como com o inibidor não-competitivo, o efeito do inibidor não pode ser revertido pelo aumento da concentração do substrato, mas neste caso ambos K m e V max são reduzidos por um fator de (+ [I]/ ). Uma concentração de inibidor igual ao, portanto irá diminuir o valor de K m e V max pela metade. Com este tipo de inibidor, K EI é infinito, pois o inibidor não pode se ligar à enzima livre e, portanto é igual a K ESI. Neste caso a equação de Lineaweaver-Burk torna-se: K m = 0 Vmax [S] + V max + [I] O valor de é mais precisamente determinado a partir de um segundo gráfico de /V max ou I/K m versus a concentração do inibidor. Em ambos os gráficos o intercepto no eixo de [I] dá o valor de. 6

7 7 - Inibidor reversível misto Para alguns inibidores o complexo ESI possui alguma atividade catalítica ou o K EI e K ESI não são iguais e nem infinitos. Nestes casos são obtidas cinéticas de inibição do tipo misto. Na inibição mista as retas obtidas nas reações sem inibidor e com inibidor sofrem intersecção acima ou abaixo do eixo /[S]. O valor de pode ser determinado através de um segundo gráfico de inclinação ou de /V max versus a concentração do inibidor. Em ambos os gráficos o intercepto no eixo de [I] dá o valor de. A inibição não-competitiva pode ser classificada como um tipo especial de inibição mista. Inibição irreversível Inibidores irreversíveis, tais como compostos organofosforados e organomercúricos, cianeto, monóxido de carbono, sulfito de hidrogênio, combinam com enzima para formar ligação covalente estável. A extensão da inibição de uma enzima é dependente da constante de velocidade (e, portanto do tempo) para a formação da ligação covalente e também da concentração do inibidor presente. O efeito de inibidores irreversíveis, que não podem ser removidos por técnicas físicas como a diálise, é reduzir a quantidade de enzima disponível para a reação. A inibição envolve reações com grupos funcionais, como hidroxilas e sulfidrilas, ou com átomos de metais no sítio ativo ou alostérico. Assim, compostos organofosforados, diisopropil-fofofluoridato, reage com a serina do sítio ativo de esterases tais como a acetilcolinesterase, enquanto compostos organomercúricos como o p-hidroximeriobenzoato reage com cisteínas, em ambos os casos resultando na formação de ligações covalentes e inibição enzimática. Tais inibidores são valiosos n estudo de sítio ativo de enzimas. Aplicações da inibição enzimática O estudo da classificação e dos mecanismos de inibição enzimática é de importância em diversos aspectos: - fornece informações sobre o mecanismo pelo qual a enzima promove a atividade catalítica (mais detalhes na seção 5.4. página 6); - fornece informações de possíveis mecanismos de regulação de atividades metabólicas in vivo; -permite a síntese de inibidores específicos para serem utilizadas como agentes terapêuticos bloqueando vias metabólicas chaves envolvidas em condições clínicas (mais detalhes na seção 8..2, página 709). Link para as figuras Chapter 5 GR0: Fig.5. Figura do estado pré-estacionário GR02: Fig.5.2 Cálculo de o GR03: Fig.5.3 Efeito da [S] na o e efeito de diferenes concentrações de inibidores GR04: Fig.5.4 Gráficos Lineaweaver-Burk, Hanes e Eadie-Hofstee GR05: Fig.5.5 Gráficos Lineaweaver-Burk mostrando o efeito de 3 tipos de inibidores (a) GR06: Fig.5.6 Gráfico Lineawever-Burk (a) e Gráfico para determinação de Ki determination (b) 7