Avaliação Quantitativa das Preparações Enzimáticas

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1 Avaliação Quantitativa das Preparações Enzimáticas Como diferenciar enzimas? Quando não podemos determinar a concentração de uma enzima devemos diferenciar as enzimas por sua atividade (moléculas não podem ser contadas) Reproduz-se em laboratório, sob condições controladas a catálise enzimática

2 Problemas Clássicos na determinação da atividade de preparações enzimáticas 1- Não se conhece a estrutura completa e, consequentemente, o peso molecular da maioria das enzimas. 2- Nas preparações enzimáticas moléculas distintas podem exercer efeitos semelhantes, por exemplo, formação de grupos redutores. 3- Pode haver enzimas inativas que aumentam o conteúdo proteico na preparação.

3 - Para que avaliação seja eficiente, o procedimento deve ser reprodutível. - Também deve-se saber qual é o substrato natural da enzima. Exemplo: xilose que por ação da glicose isomerase passa a xilulose (mesmo glicose a frutose) Como provar quem é o substrato natural?

4 Uso de Substratos não Naturais Algumas vezes o substrato não natural pode ser muito mais bem catalisado pela enzima que o substrato natural. Exemplo: Enzima beta-galactosidase hidrolisa lactose a galactose + glicose que não absorvem no UV visível. Por esta razão usa-se substrato não natural que pode ser catalisado pela enzima beta galactose ortonitrofenil. O ortonitrofenilgalactosideo quando hidrolisado forma o ortonitrofenol que em ph alcalino é desprotonado e absorvido no UV-visivel.

5 Montagem do Ensaio de Determinação da Atividade Enzimática Escolha do Substrato: Pode-se constituir um grande problema a escolha do melhor e mais adequado substrato para o ensaio. Escolha substrato que garanta a reprodutibilidade do método.

6 Concentração do Substrato: Modelo de Henri-Michaelis e Menten - excesso de substrato em relação a concentração de enzima, de forma que a hipótese de estado estacionário seja valida (velocidade de relação linear). Um excesso de substrato pode proporcionar uma saturação da enzima reduzindo assim sua atividade. Determina-se a velocidade em t próximo de zero, de modo que a concentração de S não se modifique consideravelmente.

7 Tempo de reação: A unidade do tempo e fundamental na expressão e também na determinação da atividade enzimática. Deve-se ter formado quantidade mensurável de produto, ou ter desaparecido quantidade significativa de substrato. A reação P + E ES possa ser negligenciada Velocidade = consumo de S ou surgimento de P unidade de tempo

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9 ph: ph controlado necessidade de manter grupos críticos do centro ativo no estado de ionização correto para que a reação ocorra, conduzida em velocidade máxima. ph ótimo e necessário - Efeito reversível do ph na velocidade máxima de reação. - Mudança na afinidade enzima/substrato reflete no valor de Km. - Mudança na estabilidade da enzima desnaturação irreversível em um ou em ambos extremos do ponto de ph para a atividade. Este ultimo efeito depende do tempo usado para medir a taxa de reação. Todos os 3 efeitos podem ocorrer em conjunto.

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11 Temperatura:

12 A limitada estabilidade térmica das enzimas resulta em inativação a elevadas temperaturas.

13 Inibidores: Modulação positiva ativação interação modulador com a enzima favorece a reação. Modulação negativa inibição - interação modulador com a enzima envenena a reação.

14 Expressão da Atividade Enzimática Unidade Internacionalçã UI quantidade de enzima que catalisa a transformacao de 1 micromol de substrato por minuto a 25 oc, sob condições otimizadas. Atividade específica _ número de unidades de atividade de enzima por miligrama de proteína - indicador da pureza de uma enzima atividade dividida por unidade de massa proteíca total. Atividade molar ou molecular ou numero de turnover - número de unidades de atividade por micromol de enzima ou seja, numero de moléculas de substrato transformado por uma única molécula de enzima em um minuto. Uma unidade alternativa foi sugerida pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica, mas raramente usada, que é o katal (SI), definida como a quantidade de enzima capaz de causar a transformação de 1 mmol de substrato por segundo sob condições específicas.

15 Formas específicas de expressar a atividade de uma enzima ou unidade Soxhlet/ ml, é definida como o número de mililitros de leite que podem ser coagulados em 40 minutos a 35 C.

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17 Atividade lipásica: é a quantidade de enzima necessária para produzir certa quantidade de ácido graxo, determinada por titulação em ph-stat, quer dizer, o ph é mantido constante por certo período de tempo com a adição de soda. Dois padrões podem ser utilizados: ésteres solúveis ou óleo de oliva (azeite) em uma emulsão padronizada.

18 Analise Quantitativa da atividade enzimática A análise quantitativa pode ser conduzida de várias maneiras: Ensaios diretos: medida direta da concentração do substrato ou produto em função do tempo. Ensaios indiretos: quando a medida da concentração do substrato e do produto são próximas, a geração do produto pode ser acoplada a outra reação não enzimática, que produza um sinal mais conveniente. Ensaios acoplados: a reação enzimática de interesse é acoplada a uma segunda reação enzimática, que pode ser convenientemente medida, tendo como exemplo a reação da glicose oxidase

19 Determinação da quantidade de proteínas Realiza por diferentes métodos os mais precisos são aqueles que determinam as ligações peptídicas existentes nas moléculas proteicas (Lowry, Bradford). Outros determinam elementos naturais a natureza proteica, tal como nitrogênio orgânico (Keldhjal)

20 Relações não-lineares de v versus [E]t A preparação enzimática estocada sob condições de ph ou força iônica significativamente diferentes do ótimo de reação podem levar ao carreamento destes parâmetros para a análise cinética. De forma semelhante, a presença de certos agentes de estabilização (EDTA, tióis ou cátions específicos) podem inibir a reação. A medida de velocidade pode não ser uma medida verdadeira da velocidade inicial. Isto pode ocorrer quando a concentração de substrato diminui significativamente (i.e., não segue uma cinética de primeira ordem) antes da medida do produto formado.

21 A preparação enzimática pode conter enzimas que convertam o produto a outro composto que foge da detecção do método empregado. A enzima pode ser instável sob as condições de análise (ph, temperatura, força iônica, etc.). A preparação enzimática pode conter enzimas proteolíticas que se encontram inativas sob as condições de estocagem. O método de análise pode ser impreciso em altas concentrações do produto. Os reagentes empregados para converter o produto em uma forma mensurável podem estar em condições limitantes.