Avaliação Quantitativa das Preparações Enzimáticas

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1 Avaliação Quantitativa das Preparações Enzimáticas Como diferenciar enzimas? Quando não podemos determinar a concentração de uma enzima devemos diferenciar as enzimas por sua atividade (moléculas não podem ser contadas) Reproduz-se em laboratório, sob condições controladas a Reproduz se em laboratório, sob condições controladas a catálise enzimática

2 Problemas Clássicos na determinação da atividade id d de preparações enzimáticas 1 Não se conhece a estrutura completa e, consequentemente, o peso molecular l da maioria i das enzimas. 2 Nas preparações p enzimáticas moléculas distintas podem exercer efeitos semelhantes, por exemplo, formação de grupos redutores. 3 Pode haver enzimas inativas que aumentam o 3 Pode haver enzimas inativas que aumentam o conteúdo proteico na preparação.

3 Para que avaliação seja eficiente, o procedimento deve ser reprodutível. Também deve se saber qual é o substrato natural da enzima. Exemplo: xilose que por ação da glicose isomerase passaa a xilulose (mesmo glicose a frutose) Como provar quem é o substrato natural? Através da medida da constante de Michaelis, Km. Quanto maior o valor de Km menor a afinidade da enzima por aquele substrato. Assim o substrato natural da enzima deve apresentar baixo valor de Km.

4 Uso de Substratos t não Nt Naturais Algumas vezes o substrato não natural pode ser muito mais bem catalisado pela enzima que o substrato natural. Exemplo: 1 Enzima beta galactosidase hidrolisa lactose a galactose + glicose que não absorvem no UV visível. Por esta razão usa se substrato não natural que pode ser catalisado pela enzima beta galactose ortonitrofenil. Hidrolise gera o ortonitrofenilgalactosidico que quando hidrolisado forma o ortonitrofenol que em ph alcalino li e desprotonado d (perde H) e absorvido no UVvisivel.

5 2 Ação da pepsina (tripsina) sobre a hemoglobina produzindo peptideos e medida da seguinte forma: os peptideos de cadeia pequena formados pelaação ação enzimatica não precipitam pela ação da TCA. As cadeias di pequenas são absorvidas a 280 nm e esta tende a aumentar. Atividade enzimatica unidade produzida a delta absorbância por 0,001 minuto.

6 Montagem do Ensaio de Determinação da Atividade Enzimatica 1 Escolha do Substrato Pode se constituir um grande problema a escolha do melhor e mais adequado substrato para o ensaio. Um polimero ou substâncias não definidas, como a celulose, proteinas, pectinas, entreoutros outros. Normalmente o que se observa e a ação de um conjunto de enzimas atuando sobre um substrato complexo. Escolha substrato que garanta a reprodutibilidade bld d do método.

7 2 Concentração do Substrato Modelo de Henri Michaelis e Menten excesso de substrato em relação a concentração de enzima, de forma que a hipótese de estado estacionário seja valida (velocidade de relação linear). Um excesso de substrato pode proporcionar uma saturação da enzima reduzindo assim sua atividade. Determina se a velocidade em t próximo de zero, de modo que a concentração não se modifique consideravelmente. k 1 k 2 E + S ES E + P k 1 k 2 As determinações devem ser feitas nas condições iniciais, onde a velocidade de E + P ES pode ser desprezada e ainda que, o que de [ES] é produzido na unidade do tempo é imediatamente consumido. v = k 2 [E] T [S] / Km + [S] onde v = Vm [S] / Km + [S] sendo Vm = k 2 [E] T

8 Não devemos trabalhar muito abaixo do Km e nem em valores de Km muito altos, o ideal é trabalhar com valores intermediários. Ainda pela Equação de Michaelis e Menten integrada obtemos quanto de produto após um tempo t eu tenho no meio reacional Velocidade inicial = dp/dt = cte [S] >> Km dp/dt = ds/dt = Vm [S]/ Km + [S] dp/dt = Vm [S] / [S] dp = Vm dt dp = Vm dt P Po = Vm t P = Vm t Para uma equação de cinética de Ordem zero P= Vm t PROBLEMAS: Tomar cuidado com os casos de insolubilidade do substrato no solvente, não se configurando um excesso. Um excesso de substrato pode proporcionar uma saturação da enzima reduzindo assim sua atividade.

9 3 Tempo de reação A unidade do tempo e fundamental na expressão e tambem na determinação da atividade iidd enzimática. i Deve se ter formado quantidade mensurável de produto, ou ter desaparecido quantidade significativa de substrato. A reação P + E ES possa ser negligenciada Vl Velocidade idd = consumo de S ou surgimento de P unidade de tempo

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11 4 ph ph controlado necessidade d de manter grupos críticos do centro ativo no estado de ionização correto para que a reação ocorra, conduzida em velocidade máxima. ph ótimo e necessário: Efeito reversivel do ph na velocidade máxima de reação. Mudança na afinidade enzima/substrato reflete no valor de Km. Mudança na estabilidade da enzima desnaturação irreversivel em um ou em ambos extremos do ponto de ph para a atividade. Este ultimo efeito depende do tempo usado para medir a taxa de reacao. Todos os 3 efeitos podem ocorrer em conjunto.

12 ph mantido constante durante a reação meio tamponado. A concentração da solução tampão, seu ph, mais adequados a catálise.

13 5 Temperatura Reações enzimaticamente catalisadas são influenciadas pela temperatura. Quando a temperatura se eleva, a taxa de reação aumenta. Como a medida da taxa de reação efetuada em um tempo finito, a reação devera apresentar uma temperatura ótima.

14 A limitada estabilidade térmica das enzimas resulta em inativação a elevadas temperaturas.

15 6 Inibidores Expressão da atividade enzimática Modulação positiva ativação interação modulador com a enzima favorece a reação. Modulação negativa inibiçãoibi interação modulador com a enzima envenena a reação.

16 Inibição por excesso de substrato ( Inibição Acompetitiva) Inibidor pode se ligar somente após a entrada do substrato. Uma concentração elevada de substrato conduz a união de uma segunda molécula a enzima. ks kp E + S ES E + P + S ki ESS Como P vem de ES eu considero a reação elementar como dp/dt = v = k 2 [ES] v= Vm [S] / km + S ( 1 + S/ki)

17 Inibição pelo produto Inibição Competitiva Para inibição ibi pelo Produto, este deve ter estrutura t semelhante a do substrato para competir com ele. Sendo neste caso, inibição do tipo competitiva. Este tipo de inibição conduz a eventos extrudentes, quando o produto se liga a enzima o substrato não se liga, devido a modificações estruturais. Inibidor pode se ligar somente após a entrada do substrato ks kp E + S ES E + P + P ki EP Como P vem de ES eu considero a reação elementar como dp/dt = v = k 2 [ES] 2 v= Vm [S] / S + km ( 1 + [P]/ki)

18 Expressao da Atividade Enzimatica 1 Unidade Internacionalçã UI quantidade de enzima que catalisa a transformacao de 1 micromol de substrato por minuto a 25 oc, sob condições otimizadas. Atividade específica _ número de unidades de atividade de enzima por miligrama de proteína tí indicador d da pureza de uma enzima atividade dividida por unidade de massa proteíca total. Atividade molar ou molecular ou numero de turnover número de unidades de atividade por micromol de enzima ou seja, numero de moléculas de substrato transformado por uma única molécula de enzima em um minuto. Uma unidade alternativa foi sugerida pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica, mas raramente usada, que é o katal (SI), definida como a quantidade de enzima capaz de causar a transformação de 1 mmol de substrato por segundo sob condições específicas.

19 Formas específicas de expressar a atividade de uma enzima ou unidade Soxhlet/ ml, é definida como o número de mililitros de leite que podem ser coagulados em 40 minutos a 35 C.

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21 Atividade lipásica: é a quantidade de enzima necessária para produzir certa quantidade de ácido graxo, determinada por titulação em ph-stat, quer dizer, o ph é mantido constante por certo período de tempo com a adição de soda. Dois padrões podem ser utilizados: ésteres solúveis ou óleo de oliva (azeite) em uma emulsão padronizada.

22 Analise Quantitativa da atividade enzimatica A análise quantitativa pode ser conduzida de várias maneiras: Ensaios diretos: medida direta da concentração do substrato ou produto em função do tempo. Ensaios indiretos: quando a medida da concentração do substrato e do produto são próximas, a geração do produto pode ser acoplada a outra reação não enzimática, que produza um sinal mais conveniente. Ensaios acoplados: a reação enzimática de interesse é acoplada a uma segunda reação enzimática, que pode ser convenientemente medida, tendo como exemplo a reação da glicose oxidase

23 Analise Quantitativa da atividade enzimatica Para a obtenção de uma análise quantitativa é necessário saber: Toda estequiometria de uma reação catalítica Se a enzima requer adição de cofatores como um íon ou coenzima. A dependência da enzima sob a concentração do cofator ou substrato. OpHótimo. A temperatura pela qual apresenta alta atividade. iidd a enzima esta estável e Oprocedimentoparadeterminaçãodoaparecimentoe desaparecimento do produto de reação ou substrato, respectivamente, ou de um intermediário (especialmente quando estes são coloridos ou absorvidos em luz UV).

24 Determinação da quantidade de proteínas. Realiza por diferentes métodos os mais precisos são aqueles que dt determinam as ligações gç peptídicas pp existentes nas moléculas proteícas (Lowry, Bradford). Outros determinam elementos naturais a natureza proteíca, tal como nitrogênio orgânico (Keldhjal)

25 Técnicas empregadas no Estudo das Enzimas 1 Análise da velocidade de reação catalítica existem duas formas medições sob condições que mantenham o estado de equilíbrio aplicando a equação de Michaelis e Menten e determinar a velocidade de reação pela concentração de S ou E. 2 Análise do equilíbrio i de Reação Estabelecido em segundos ou pouco minutos. Espectrofotometria Método simples ondeamedidadaabsorçãode luz na faixa do ultravioleta e do visível é feita de acordo com a lei de Lambert Beer, que correlaciona diretamente a absorbância em dado comprimentodeondacomaconcentraçãodoanalito(substratoou produto formado) Ex : alfa amilases que clivam o amido em glicose e sacarose, que são detectadas pelo método do DNS (ácido 3,5 dinitrosalicílico), onde o DNS reage com os grupos redutores da glicose e da sacarose, gerando um grupo cromóforo, detectável em 540 nm.

26 Fluorescência quantificação dos produtos das reações enzimáticas em baixas concentrações de analito, a intensidade de emissão fluorescente é diretamente proporcional a concentração mais seletivo já que é necessário utilizar comprimentos de onda de excitação e emissão do analito. Ex: proteases que utilizam como substratouma proteína (transferrina) modificada covalentemente com moléculas deisotiocianato de fluoresceína, exibindo absorbância em 495 nm e emissão em 525nm. Com a atuação da protease, as moléculas de isotiocianto de fluoresceína são liberadas, permitindo um aumento da intensidade de emissão em 525 nm.

27 Bioluminescência Os métodos de bioluminescência contam com a produção de luz durante a reação enzimática, diferentemente dosoutrosmétodosóticos,aquantidadedeluz medida é transiente durante a velocidade inicial de reação enzimática há um nível constante de luz detectada, de baixa intensidade, que depois é integrada por vários minutos no instrumento. E como os fótons são oproduto da reação, estes são proporcionais i a quantidade de substrato consumido. Ex : a luciferase, proviente de vagalumes, que age como um indicador para qualquer reação enzimática primária que gere ATP, catalisandoa descarboxilação oxidativa da luciferina.

28 Nefelometria Também conhecido como espalhamento de luz, este método consiste em monitorar a alteração da turbidez no meio durante a reação enzimática. Em baixa turbidez, a intensidade de luz espalhada é proporcional à concentração. Ex: lipase, que hidrolisa os lipídios em ácidos graxos, gerando uma diminuição na turbidez em meios aquosos.

29 Métodos Eletroquímicos de detecção amperométricos (em reações com oxidases e desidrogenases, para medir a produção de H2O2 e fosfato inorgânico), ),potenciometricos (empregam eletrodos para detecção de gases, como a NH3 e o CO2, ou eletrodos específicos para íons, como na reação da penicilinase, que é medida do por I ou CN ) e condutimetricos (é a urease, que ao hidrolisar a uréia, uma molécula neutra,libera 4 íons (2 NH4+, HCO3, OH ) e aumenta a condutividade da solução.

30 Outros Métodos de Detecção Análise Radioativa É avaliado quando o substrato é marcadocomisótopo ió radioativo, i o qual será perdido ou transferido durante a reação a ser estudada. É um método extremamente sensível para análise cinética enzimática. Ex: é o ensaio para determinar a concentração de GTP(guanosina 5 trifosfato) e GDP (guanosina 5 difosfato), que estão envolvidos na regulação de hormônios, síntese de proteínas e gluconeogênese.

31 Titulação Automática É utilizada quando a reação produz ou consome ácido ou base. Titula se na solução ácido ou base para que o ph continue constante. A quantidade de ácido ou base consumido é o valor da reação catalítica enzimática. Análises de reações com alta velocidade Stopped Flow Temperature Jump

32 Relações não lineares de v versus [E]t A preparação enzimática estocada sob condições de ph ou força iônica significativamente diferentes do ótimo de reação podem levar ao carreamento destes parâmetros para a análise cinética. De forma semelhante, a presença de certos agentes de estabilização (EDTA, tióis ou cátions específicos) podem inibir a reação. A medida develocidadepodenão d d ser uma medida verdadeira da velocidade inicial. Isto pode ocorrer quando a concentração de substrato diminui significativamente (i.e., não segue uma cinética de primeira ordem) antes da medida do produto formado.

33 A preparação p enzimática pode conter enzimas que convertam o produto a outro composto que foge da detecção do método empregado. A enzima pode ser instável sob as condições deanálise (ph, temperatura, força iônica, etc.). A preparação p enzimática pode conter enzimas proteolíticas que se encontram inativas sob as condições de estocagem. O método de análise pode ser impreciso em altas concentrações do produto. Os reagentes empregados para converter o produto em uma forma mensurável podem estar em condições limitantes.