QBQ 0316 Bioquímica Experimental. Carlos Hotta. Análise de dados (P1 e P2)

Transcrição

1 QBQ 0316 Bioquímica Experimental Carlos Hotta Análise de dados (P1 e P2) 26/08/2016

2 Análise de resultados P2

3 Passo 1: calcular massa de glicose em cada pocinho 5 µmol glicose 1000 µl 5000 nmol glicose 1000 µl 50 nmol glicose 10 µl 1 mol glicose 180 g 1 nmol glicose 180 ng 50 nmol glicose 9000 ng Em 10 µl de solução padrão de glicose há 9 µg glicose Massa de tubos glicose (µg) Branco A540

4 Passo 2: retirar os Branco das Absorbâncias medidas Passo 3: plotar o gráfico da massa de glicose x Absorbância A A massa de glicose (µg) massa de glicose (µg) Passo 4: retirar dados discrepantes e escolher os limites da curva-padrão

5 Passo 5: inferir a equação da reta y = x R² = A massa de glicose (µg) A 540 = xM glicose M glicose = (A ) Equação só pode ser utilizada para absorbâncias entre e 0.255

6 Passo 6: converter absorbâncias das amostras em massa de glicose A540 - branco M glicose (µg) Lisado L10x L50x Passo 7: calcular a concentração de glicose no lisado, a massa de glicose total no lisado e a massa de glicose por g de levedura 18.5 µg glicose 25 µl lisado 740 µg glicose 1 ml lisado 8880 µg glicose 12 ml lisado 8.8 mg 1 g levedura

7 Análise de resultados P3

8 Análise de resultados P3 0,2 g albumina 1000 ml 0,2 mg albumina 1 ml 200 µg albumina 1000 µl 2 µg albumina 10 µl Em 10 µl de solução padrão de albumina há 2 µg proteína Massa de tubos proteína (µg) Branco A540

9 Passo 2: retirar o Branco das Absorbâncias medidas Passo 3: plotar o gráfico da massa de proteína x Absorbância Passo 4: retirar dados discrepantes e escolher os limites da curva-padrão Passo 5: inferir a equação da reta y = x R² = A massa de proteína (mg) Equação só pode ser utilizada para absorbâncias entre e 0.604

10 Passo 6: converter absorbâncias das amostras em massa de proteína e, depois, em concentração de proteína A595 - branco M proteína (µg) Volume L50x (µl) [proteína] (µg/µl) Tubo A Tubo A Tubo A Tubo A µg/µl A concentração de proteína no L50x é µg/µl

11 Passo 7: calcular a concentração de proteína no lisado, a massa de proteína total no lisado e a massa de protepina por g de levedura A concentração de proteína no L50x é µg/µl L50x µg/µl L1x (lisado) 4.40 µg/µl Se no lisado há 12 ml, temos: µl x 4.40 µg/µl = µg ou 52.8 mg de proteína Para cada 1 g de levedura, extrai-se 52.8 mg de proteína

12 A absorbância pode ser maior que 1? A = -log I/I 0 = 0 I/I 0 = 10 0 = 1 A = -log I/I 0 = 1 I/I 0 = 10-1 = 0,1 I = I 0 -> a luz incidente é igual a luz recuperada I = 0,1 I 0 -> a luz recuperada é somente 10% da luz incidente

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14 A ciclooxigenase regula diversos processos

15 O paracetamol inibe principalmente a COX-2 O paracetamol também atua no sistema endocanabinóide?

16 P4 - Determinação da atividade enzimática

17 O que é uma α-glicosidase? as α-glicosidases quebram as ligações alfa-1,4 entre glicoses as β-glicosidades quebram as ligações beta-1,6 entre glicoses maltose as α-glicosidases quebram principalmente amido e dissacarídeos, como a maltose

18 Quanto temos de α-glicosidase? Não é prático medir diretamente o número de α-glicosidases na solução de lisado No entanto, é fácil medir a atividade enzimática da α-glicosidase A atividade de uma enzima pode ser estimada medindo-se a formação de um produto ou o desaparecimento de substrato S P (reação lenta) E + S ES E + P (reação rápida) V = k [E] [S] Assim, se [S] inicial é praticamente constante, a velocidade inicial da reação é diretamente proporcional à concentração de enzima

19 Como medir a velocidade de uma reação? V = k [E] [S] Se menos de 5% do substrato for consumido, pode-se assumir que a V inicial é constante e que é diretamente proporcional à concentração de enzima.

20 Medida da velocidade inicial 1. Construir uma curva de [P] x tempo e ver se é linear

21 Determinação da atividade enzimática do lisado (U) 1 unidade (U) quantidade de enzima que transforma 1 µmol de substrato (ou 1 µmol de produto) em 1 minuto A medida da atividade enzimática pode ser facilitada se o produto ou o substrato forem coloridos ou fluorescentes p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc)

22 Atividade enzimática do lisado (U) - quantidade de enzima que transforma 1 µmol de substrato (ou 1 µmol de produto) em 1 minuto Concentração de atividade enzimática do lisado (U/ml) Atividade enzimática contida em 1 ml de solução Atividade específica do lisado (U/mg) - Atividade enzimática contida em 1 mg de proteína (medida de pureza da enzima) Temperatura e ph são controlados!!

23 P4 - Determinação da atividade enzimática Monitoramento da concentração do produto ao longo do tempo, mantendo-se a mesma concentração de substrato e lisado Diferentes concentrações de lisado (L10x, L50x e L500x) serão utilizado para se observar se há síntese de produtos com velocidade constante em ph 7.0 Manter reagentes no gelo, iniciar a reação transferindo para o banho a 30 o C e parar a reação adicionando tampão bicarbonato (ph 11) A absorbância (420 nm) será medida no espectrofotômetro de microplacas (200 µl). Cada ponto será medido três vezes.

24 P5 - Determinação do ph ótimo

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32 P5 - Determinação do ph ótimo Monitoramento da atividade enzimática do lisado em diferentes tampões com ph diferentes (4.0, 5.0, 6.0, 8.0 e 9.0) Usar a diluição com melhor padrão de crescimento de absorbância Os dados da P4 serão utilizados para se medir a atividade enzimática em ph 7.0