Aula 4: Enzimas Cinética e Regulação

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1 Disciplina de Engenharia de Proteínas Curso de Ciências Biológicas Aula 4: Enzimas Cinética e Regulação Prof. Marcos Túlio de Oliveira mtoliveira@fcav.unesp.br Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho

2 Enzimas GRANDE maioria formada por proteínas (algumas enzimas são formadas por RNA)

3 Enzimas GRANDE maioria formada por proteínas (algumas enzimas são formadas por RNA) Função: CATALIZADORES de reações químicas (aceleração das reações químicas, especificidade pelo substrato, funcionam em diversas condições de temperatura e ph)

4 Enzimas + +

5 Enzimas apoenzima holoenzima Enzima holozima Parte Não proteica (cofator) metal coenzima. Apoenzima parte proteica

6 Coenzimas participam do ciclo catalítico das enzimas recebendo ou fornecendo grupos químicos para a reação

7 Enzimas

8 Enzimas Classificação Normalmente se adiciona o sufixo ase ao nome do substrato ou à atividade realizada: Urease hidrolisa a uréia DNA-polimerase polimeriza DNA Agora. Nomenclatura oficial das enzimas é dada pela Enzyme Comission da International Union for Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) : Exemplo... ATPase: EC é uma hidrolase atua num anidrido o anidrido contém fosfato esse anidrido é ATP Óxido-redutases ( Reações de óxidoredução). 2. Transferases (Transferência de grupos funcionais) 3. Hidrolases (Reações de hidrólise) 4. Liases (Adição a ligações duplas) 5. Isomerases (Reações de isomerização) 6. Ligases (Formação de ligações covalentes com gasto de ATP) Transferência de elétrons Se uma molécula se reduz, há outra que se oxida. grupos aldeído gupos acila grupos glucosil grupos fosfatos (quinases) Transformam polímeros em monômeros. Atuam sobre: Ligações éster Ligações glicosídicas Ligações peptídicas Ligações C-N Entre C e C Entre C e O Entre C e N Entre C e O Entre C e S Entre C e N Entre C e C

9 Como Enzimas Funcionam... sítio ativo (catalítico) substrato enzima

10 Como Enzimas Funcionam...

11 Como Enzimas Funcionam... mudança de energia durante a reação como a reação progride

12 Como Enzimas Funcionam... energias de ativação variação de energia livre padrão (bioquímica)

13 Como Enzimas Funcionam... É aqui que as enzimas agem!!!... e não aqui!

14 Como Enzimas Funcionam... energia de ativação SEM catalizador energia de ativação COM catalizador

15 Como Enzimas Funcionam... intermediários da reação

16 Como Enzimas Funcionam... passo limitante da reação

17 Enzimas A energia de ativação é monstruosa!!! + +

18 Como Enzimas Funcionam... Compare esses números! Enzima Velocidade na ausência de enzima Reações/segundo Velocidade da reação catalisada Reações/segundo Poder catalítico Anidrase carbônica 1.3 X X X 10 6 Triosefosfato isomerase 4.3 X X 10 9 Carboxipeptidase A 3.0 X X AMP nucleosidase 1.0 X X Nuclease de estafilococos 1.7 X X Número de turnover ou de renovação: quantas vezes a enzima completa o ciclo da reação em um segundo Número de turnover = moles de S catalisado por segundo moles de enzima

19 Como Enzimas Funcionam... sítio ativo (catalítico) formação de ligações covalentes transientes com o substrato! enzima substrato

20 Como Enzimas Funcionam... Intermediário ES (E e S ligados covalentemente)

21 Como Enzimas Funcionam... energia de ligação Maior fonte de energia livre usada por enzimas para abaixar as energias de ativação das reações

22 Como Enzimas Funcionam... sítio de ligação sítio ativo (catalítico) formação de várias ligações fracas dão especificidade para ES! enzima substrato

23 Como Enzimas Funcionam...

24 Como Enzimas Funcionam... + formação de várias ligações fracas dão especificidade para ES!

25 Como as Enzimas Funcionam... Modelo Chave-Fechadura Modelo chave-fechadura Nesse modelo, o sítio ativo da enzima é pre-formado e tem a forma complementar à molécula do Substrato, de modo que outras moléculas não teriam acesso a ela. Modelo de encaixe induzido Modelo de encaixe induzido Nesse modelo, o contacto com a molécula do substrato induz mudanças conformacio-nais na enzima, que otimizam as intera-ções com os resíduos do sítio ativo. Esse é o modelo aceito hoje em dia.

26 Exemplo do modelo de encaixe induzido (Carbopeptidase) A esqueda: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos de Tyr 248 (em amarelo) e de Glu 270 (azul claro), e um átomo de Zn 2+ (cinza). A B A direita: A ligação do substrato L-fenil lactato (em vermelho) causa uma profunda mudança conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A.

27 Exemplo do modelo de encaixe induzido (Carbopeptidase) A esqueda: o sítio catalítico dessa enzima é formado pelos resíduos de Tyr 248 (em amarelo) e de Glu 270 (azul claro), e um átomo de Zn 2+ (cinza). A B A direita: A ligação do substrato L-fenil lactato (em vermelho) causa uma profunda mudança conformacional nas vizinhanças do sítio ativo da carboxipeptidase A.

28 Como Enzimas Funcionam...

29 Como Enzimas Funcionam... substrato estado de transição

30 Cinética Enzimática Determinar a taxa (velocidade) da reação e como esta muda em resposta a mudanças nos parâmetros experimentais abordagem central para estudar o mecanismo de reações catalisadas por enzimas.

31 [S] Cinética Enzimática [S] muda com o passar do tempo em uma reação enzimática in vitro. E daí? tempo

32 [S] Cinética Enzimática [S] [E] Enzima funciona a todo vapor e a mudança na [S] é mínima durante o estágio inicial da reação tempo

33 Cinética Enzimática É por isso que a gente olha para a velocidade inicial (V 0 )

34 Praticamente linear; ou seja, quanto mais substrato, maior a V 0 Cinética Enzimática Saturação! Não adianta adicionar substrato, a V 0 não muda significativamente.

35 Cinética Enzimática [S], portanto [ES] é favorecido [S], portanto [E] é favorecido

36 Cinética Enzimática [S], portanto [ES] é favorecido [S], portanto [E] é favorecido

37 Cinética Enzimática Equação de Michaelis-Menten: V 0 = V max [S] K m + [S]

38 V 0 = V max [S] K m + [S]

39 Cinética Enzimática

40 Cinética Enzimática

41 Cinética Enzimática

42 Cinética Enzimática K m = k -1 = K d k 1 Nesta condição, K m mede a afinidade da enzima pelo substrato

43 Interação Proteína-Ligante concentração do ligante porcentagem dos sítios de ligação ocupados concentração constante da proteína

44 Cinética Enzimática k cat descreve a taxa do passo limitante da reação equivalente ao número de moléculas de substrato convertidas a produto em uma unidade de tempo em uma molécula de enzima, quando a enzima está saturada com substrato

45 Cinética Enzimática Número de turnover = moles de S catalisado por segundo moles de enzima

46 Eficiência catalítica k cat /K m Parâmetro mais adequado para comparações cinéticas

47 % atividade enzimática máxima Fatores que afetam a atividade enzimática Condições do meio que afetam estabilidade protéica ph temperatura O ph ótimo de uma enzima reflete variações no estado de ionização de resíduos de aminoácidos do sítio ativo. ph ótimo=1,5 ph ótimo=6,8 ph ótimo=9,9

48 % atividade enzimática máxima Fatores que afetam a atividade enzimática 1. Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimas Variações de ph: ph ótimo Variações de temperatura: temperatura ótima 100- Temperatura ótima Desnaturação térmica da proteína Pouca energia para a reação acontecer Ao contrário da curva em forma de sino no caso da atividade enzimática versus ph, a enzima só está desnaturada em temperaturas acima da temperatura ótima.

49 Cinética Enzimática y = a. x + b equação da reta

50 Inibição Enzimática irreversível

51 Inibição Enzimática reversível

52 V max não muda Inibição Enzimática K m aumenta

53 Inibição Enzimática V max diminui K m diminui

54 Inibição Enzimática V max diminui K m aumenta

55 Enzimas Reguladoras presentes em sistemas multienzimáticos

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57 Enzimas Reguladoras geralmente possuem subunidades múltiplas... sítio ativo e sítio(s) regulador(es) em subunidades separadas

58 Enzimas Alostéricas formas mais ou menos ativas são geradas por alterações de conformação induzidas por um ou mais moduladores...

59 Enzimas Alostéricas formas mais ou menos ativas são geradas por alterações de conformação induzidas por um ou mais moduladores...

60 Enzimas Alostéricas X sigmóide hiperbólica

61 Enzimas Alostéricas alteração no K 0.5 alteração na V max

62 Modificações Covalentes Reversíveis

63 Modificações Covalentes Reversíveis

64 Modificações Covalentes Reversíveis

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66 Proproteínas, Proenzimas e Zimogênios precursor inativo que precisa ser clivado para gerar a forma ativa... modificações irreversíveis pró-colágeno colágeno fibrogênio fibrina protrombina trombina pró-insulina insulina quimotripsinogênio quimotripsina tripsinogênio tripsina

67 Proproteínas, Proenzimas e Zimogênios

68 Proproteínas, Proenzimas e Zimogênios

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