Mecanismo de reação de uma enzima com substrato único. A enzima (E) liga o substrato (S) e liberta o produto (P).

Transcrição

1 CINÉTICA ENZIMÁTICA

2 Cinética Enzimática Estudo da velocidade de uma reação química que ocorre na presença de uma enzima a) Medir as velocidades das transformações que se processam; b) Estudar a influências das condições de trabalho, como concentrações de ativadores, inibidores, reagentes, temperatura, ph; c) Correlacionar por modelos empíricos, ou matemáticos as velocidades das transformações com alguns fatores que afetam a velocidade; d) Colaborar na otimização do processo considerado; e) Estabelecer critérios para o controle do processo; f) Projetar reatores mais adequados

3 Cinética Enzimática

4 A cinética enzimática é o estudo do mecanismo pelo qual as enzimas ligam aos substratos e os transformam em produtos. São utilizados dados sobre a velocidade de reação de enzimas através de ensaios enzimáticos. Mecanismo de reação de uma enzima com substrato único. A enzima (E) liga o substrato (S) e liberta o produto (P).

5 MedidadaVelocidade O primeiro problema que se apresenta ao estudar a cinética da reação é a medida de sua velocidade em condições experimentais conhecidas; Suponhamos que seja possível medir a concentração de substrato ou do produto durante o desenvolvimento da reação no seu início. Essas medidas conduzirão a curvas do tipo representada abaixo:

6 MedidadaVelocidade Observa-se que as velocidade de consumo de substrato e de formação de produto variam com o tempo; Mesmo mantendo a temperatura e ph constante, a concentração de enzima também pode diminuir, levando em conta alguns produtos que podem tornar-se inibidores da ação catatílica da enzima Portanto, o único instante em que as condições experimentais são conhecidas é no instante inicial; Por esse motivo a velocidade de reação enzimática deve ser calculada sempre que possível no instante t o

7 MedidadaVelocidade Em muitos casos as reações enzimáticas podem ser medidas no tempo inicial; Porém em alguns casos isto não é possível, neste caso, a velocidade de reação é medida por um velocidade média de consumo ou de produção de substâncias, ou pela variedade de uma propriedade do sistema, como textura, viscosidade, absorbância, etc.

8 MedidadaVelocidade A velocidade é mais elevada no início e vai decrescendo com o tempo. Isto acontece essencialmente porque: P v o S E reação mais lenta P (i) com o aumento de [P], começa a dar-se também a reação inversa, P S (ii) [S] vai decrescendo ao longo do tempo de reação, o que também diminui a velocidade da reação direta S P. reação inicial (mais elevada) (iii) se a reação for muito prolongada, começa a haver desnaturação da molécula enzimática. Tempo (t) Para evitar estes problemas, utiliza-se sempre a velocidade inicial (v o ), uma vez que se estará então a contabilizar apenas S P, com [S] conhecida e [P] = 0:

9 InfluênciadaConcentraçãode A- Concentração de Enzima Enzima Traçando um gráfico com as velocidades obtidas nestas experiências, em função das concentrações de enzima, verificamos que a variação é linear [E]

10 InfluênciadaConcentraçãode B- Concentração de substrato substrato A relação entre a concentração de substrato e as velocidades iniciais obtidas é hiperbólica. V 0 [S]

11 InfluênciadaConcentraçãode substrato Vitor Henri (903): E liga-se ao S para formar ES passo obrigatório; Leonor Michaelis e Maud Menten (93) E combina-se reversivelmente com S ES k E + S ES k 2 ES se rompe E e P k 3 ES E + P

12 InfluênciadaConcentraçãode substrato Qualquer instante da reação: E e ES; [S] = velocidade da reação [S]; V máx = todas as moléculas de E estiverem na forma ES enzima saturada ; [S]: estado pré-estacionário ES; Estado estacionário [ES] = cte; V 0 estado estacionário.

13 Equação Michaelis-Menten Curva: possui a mesma forma para a maioria das enzimas; Expressa pela Equação de Michaelis e Menten; Hipótese: limitante quebra de ES E + P.

14 Equação Michaelis-Menten Equação da velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e com um único substrato; Relação quantitativa entre a V 0, a V máx e a [S] inicial relacionadas através de K m. V 0 = V K máx m + [ S] [ S]

15 Equação Michaelis-Menten Relação numérica: V 0 é metade de V máx ; V0 = V máx 2 k m = afinidade pelo substrato; K m afinidade V máx é proporcional à [E].

16 Significado de K m e V máx Equação Michaelis e Menten = dependência hiperbólica; Mecanismos de reação diferentes catalisam reações com 6 ou 8 passos; Significado e magnitude de V máx e K m varia; K m : depende de aspectos específicos do mecanismo de reação.

17 Significado de K m e V máx k2 + K m = KK 3 << K 2 afinidade da enzima; K 3 >> K 2 ; K 3 e K 2 são comparáveis a K m função complexa; V máx : número de passos da reação e identidade dos passos limitantes. k k 3

18 Significado de K m e V máx K K 2 K 3 E + S ES EP E + P K - K -2 Enzima na saturação: EP e V máx = k 3.x=k.e K cat = velocidade limitante de qualquer reação enzimas saturadas; K cat e K m = ambiente celular, concentração do substrato e química da reação.

19 Lei de Michaelise Menten O modelo cinético de Michaelis e Menten é um dos mais aceitos cujo o objetivo basico é explicar a influência da concentração iniciais de enzima e de substrato na velocidade inicial de reação enzimática; As hipóses básicas do modelo são: a) O substrato e a enzima reagem reversivelmente entre sí, formando um composto intermediário, denominado complexo enzima-substrato; b) O complexo formado ou se decompõe, ou reage com outra substancia regenerando a enzima e formando os produtos da reação Consideremos o caso mais simples possível: a) A formação do composto enzima-substrato se dá na proporção de mol de substrato para mol da enzima, produzindo mol do complexo; b) O complexo formado se decompõem sem reagir com outras substâncias existente no sistema

20 Equaçãode Michaelis-MentenMenten Comportamento é explicado pela formação do complexo enzima-substrato ES. A enzima liga-se ao substrato reversivelmente formando o complexo ES Reação rápida k E + S ES k 2 2. O complexo ES dissocia-se em enzima livre e produto da reação Reação mais lenta k 3 ES E + P.A reação 2, mais lenta, limita a velocidade global da reação..a velocidade é proporcional à concentração do complexo ES..A cada momento a enzima existe na forma livre e no complexo ES..A velocidade máxima (V máx ) da reação ocorre quando todas as enzimas estão associadas as moléculas de substrato.

21 Dedução da Equação Michaelis-Menten Pressuposto: não há transformação de produto em substrato Reações de formação e dissociação do complexo ES: k E + S ES P + E k 3 e-x s-x k 2 x V k 2 Onde: [E] e [S] são as concentrações da enzima e do substrato livres. K : constante de velocidade de formação do complexo; K 2 : constante de velocidade de dissociação do complexo; K 3 : constante de decomposição do complexo formando produto V: velocidade de formação do produto s: molaridade inicial do substrato e: molaridade inicial da enzima x : molaridade do complexo no instante t

22 Dedução da Equação Michaelis-Menten dx dt = k ( e x)( s x) k2. x k3. x x k 2 Admitindo que a concentração de substrato é muito maior que a da enzima, podemos desprezar x, em relação a s: dx dt = k e x) s k2. x k ( 3 Considerando que a reação ocorra inicialmente num tempo muito curto, micro-segundos, a concentração do complexo pode ser dita constante, então: dx = 0 hipotese de Briggs e Haldane) dt. x Separando x, que vai definir a velocidade do complexo em formar produto, temos: Dividindo tudo por k e usando a constante de Michaelis, k. e. s + k + k = x = : k k 2 + k3 + k. s 3. s k. e. s Vem: k2 + k m = x = k k e. s m + k 3 s

23 Dedução da Equação Michaelis-Menten Agora é possível calcular a Velocidade de formação de produto, Correlacionando v = k. 3 x = k3. e k O máximo valor da velocidade será alcançado quando toda enzima estiver na forma de complexo, isto é, x=e, então a velocidade máxima será: s m + s Equação de Michaelis e Mentem: S : maior afinidade Permite, após determinação experimental das variações de v em função de [S], obter o valor de V max e calcular KM S 2 : menor afinidade... K M é uma medida da afinidade da enzima para o substrato (= /K M ) (K M elevado afinidade baixa) K M K M2

24 Linearização da Equação Michaelis-Menten Devido às dificuldades de cálculo de K M através da equação de Michaelis - Menten, procurou-se obter uma representação linear da relação entre V 0 e S que pudesse ser traduzida por uma reta.

25 B- Concentração de substrato: determinação dos parâmetros cinéticos (Km e V max ) Exemplo velocidades iniciais de reação da fosfatase ácida a várias concentrações de glicerol, [S].

26 EXEMPLOS DE APLICAÇÃO

27 EXEMPLOS DE APLICAÇÃO

28 INFLUENCIA DA PRESENÇA DE INIBIDOR Inibidor: substância que provoca diminuição da velocidade de reação; Inibidor irreversível: quando bloqueia parcial ou totalmente a enzima; Inibidor reversível: quando reagem reversívelmente com a enzima; O inibidor, pode ser um substrato ou um produto; Exemplo: a) a invertase que catalisa a sacarose, quando presente em altas concentrações inibe a enzima; b) a alfa amilase que catalisa o amido em dextrina e maltose pode ser inibida em determinada fase pelo produto; c) A inibição pode ser competitiva, não competitiva e incompetitiva

29 INFLUENCIA DO EXCESSO DE SUBSTRATO k E + S ES k 2 k 3 ES + S ES2 (Complexo não reativo) k 4 k 5 ES E + P V V Vmax V = VmaxS S 2 k m + S + k i onde ki é a constante de inibição; S Para encontrar as constantes faz-se a inversão segundo Lineweaver-Burk

30 INFLUENCIA DO EXCESSO DE SUBSTRATO V = Vmax + k m Vmax. S + VmaxK i X S ª Hipótese: para valores de S<<ki a equação se reduz em, V = Vmax + k m. Vmax S /V K m /v max -/k m /S

31 INFLUENCIA DO EXCESSO DE SUBSTRATO V = Vmax + k m Vmax. S X + VmaxK i S 2ª Hipótese: para valores de S>>k m a equação se reduz em, V = Vmax + VmaxKi S /V /V max /v max K i S Os valores de V max determinados em ambos os gráficos devem ser próximos.

32 INIBIÇÃO COMPETITIVA Inibidor competitivo concorre com o S pelo sitio ativo da E livre. I análogo não metabolizável, derivado de um S verdadeiro, S substituto da E ou um P da reação. I compostos com estrutura molecular lembra S afinidade da enzima pelo substrato [substrato] necessária para obter a mesma [ES] Km aparente da enzima

33 INIBIÇÃO COMPETITIVA Indicando por I a fórmula molecular do inibidor e com i, sua molaridade inicial, o modelo Michaelis e Menten pode ser representado pelas seguintes equações químicas: k E + S ES P + E e-x-y s-x k 2 x v i k 3 k 4 k 6 E + I EI P + E e-x-y i-y k 5 y Onde : v i Velocidade de formação de produto, obviamente menor que v, da equação sem inibição

34 Na prática, s>>x e i>>y: dx dt = dy dt k = INIBIÇÃO COMPETITIVA ( e x y) s ( k2 k3 + k ( e x y) i ( k5 k6 4 + k E + S ES v i P + E e-x-y s-x k x k 2 k 3 s ). x ) y k 4 k 6 E + I EI P + E e-x-y i-y k 5 y Onde : Vale destacar que a reação entre a enzima e o inibidor pode não correr, formando o P,consequentemente, k 6 =0 Fazendo dx/dt=dy/dt=0 (hipotese de Briggs e Haldane)

35 x = k e. s i ( + k INIBIÇÃO COMPETITIVA m ) + i s k + k fazendok m = k 2 + k3 k5, e ki = k 4 6 A velocidade, v será dada pela equação: i v i = k3. x = k3. e = V k m s i ( + k i ) + s

36 INIBIÇÃO COMPETIVA Linearizando pelo método Lineawer-Burk: v i = V + k m ( + V i k i ). s

37 INIBIÇÃO COMPETITIVA Linearizando pelo método Lineawer-Burk: Equação de Michaelis e Menten [ S] V = V máx K + [ I ] [ S] K Lineweaver-Burk V = V máx + m K m + V [ I ] máx K I I + [ S]

38 INIBIÇÃO COMPETITIVA v i Dividindo por Obtém-se a relação entre a velocidade de reação sem inibidor e com inibidor. s v = V v k k + s m m = +. i s = V. v k k s i i i ( m + ) km( + ) + s k i v vi Verifica-se que é possível trabalhar com concentrações de substratos relativamente altas (matematicamente, s ) a influência do inibidor pode tornar-se desprezível. v i V V 0 I = + K I K m ( [ ]) [ I ] K + S m [S] = influência do [I] desprezível.

39 INIBIÇÃO COMPETITIVA Esta tendência pode ser observado no exemplo númerico representado na Figura abaixo, onde V=6,0 mg/l; km=2,50 mg/l e ki=,60mg/l Exemplos de inibição competitiva: inibição da glicose na invertase, durante v hidrólise da sacarose; i Inibição pela alfa dextrina na alfaamilase durante a hidrólise do amido

40 INIBIÇÃO COMPETITIVA v i - sem inibidor 2- com inibidor na concentração [I] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I]

41 INIBIÇÃO NÃO COMPETITIVA K I E + S K S ES E + P + + I I EI + S K I K 2 [ E][ I] K = = [ ES ][ I] [ EI ] [ EIS ] K S S EIS Michaelis-Menten v I = K m ( + Vmax [ S] [ I] ) + [ S]( + K I [ I] ) K I v i Lineweaver-Burk v = K V m max ( + [ I] ) K [ S] I + V max ( + [ I] ) K I

42 INIBIÇÃO NÃO COMPETITIVA Equação da velocidade: V = V máx K m + K [ S] [ I ] [ S] I + + [ I ] K I Lineweaver-Burk V K [ ] = m I + [ I ] + [ ] + Vmáx K I S Vmáx K I

43 INIBIÇÃO NÃO COMPETITIVA - sem inibidor 2- com inibidor na concentração [I] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I]

44 INIBIÇÃO INCOMPETITIVA Inibidor incompetitivo se liga reversivelmente, em um sítio próprio, ao complexo ES. I não tem semelhança estrutural com o S I favorece a formação do ES Km e Vmax da enzima

45 INIBIÇÃO INCOMPETITIVA E + S K S ES K 2 E + P + I EIS K = [ ES ][ [ EIS I ] ] K I V max [ S ] Michaelis-Menten v I = [ I ] + K i K m + [ I ] + K I [ S ] Lineweaver-Burk v = K V m max [ S ] + V max ( + [ I ] K I )

46 INIBIÇÃO INCOMPETITIVA V = + V K + I máx [ I ] m [ ] K K I I + [ S] [ S] V K = m [ I + ] [ ] + Vmáx S Vmáx K I

47 INIBIÇÃO INCOMPETITIVA - sem inibidor. 2- com inibidor na concentração [I] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I]

48 INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL Combinam-se com um grupo funcional destruição; União covalente inibidor e enzima. V máx e K m =

49 INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL Equação de Michaelis e Menten: V I ( V k [ EI ) = ] máx 3 K m [ S] + [ S]

50 INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL Lineweaver-Burk: V I = V máx K 3 + K [ EI] V K [ EI] [ S] máx m 3

51 C- Efeito do ph INFLUÊNCIA DO PH Os ph extremos modificam irremediavelmente a estrutura das enzimas, quer devido a desnaturação, quer devido a alterações na ligação entre apoenzima e coenzima As enzimas podem apresentar dois tipos de curva de atividade em função do ph

52 C- Efeito do ph INFLUÊNCIA DO PH possível efeito duma alteração de ph ao nível do centro ativo de um enzima: A. ph óptimo B. ph inferior ao óptimo (maior [H+])

53 C- Efeito do ph INFLUÊNCIA DO PH Nem todas as enzimas têm o mesmo ph. Por exemplo, a pepsina, que hidrolisa proteínas a péptidos no estômago, extremamente ácido, e a tripsina, que hidrolisa péptidos a aminoácidos nas condições alcalinas do duodeno, têm óptimos de ph adaptados ao seu ambiente Em laboratório, quando estudamos a atividade de um enzima, temos que ter o cuidado de incluir um sistema tampão no meio de ensaio, de modo a estabilizar o ph;

54 INFLUÊNCIA DO PH ph 5 e 8 = não afeta a atividade; Declínio entre ph 6,8-8 e 6,8-5 = forma iônica não adequada; 5 > ph > 8 = inativação irreversível.

55 INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA T velocidade de reação = energia cinética; T muito elevadas = desnaturação da enzima Rompidas as pontes de hidrogênio alterações estruturas = nova conformação; T desnaturação pouco acima da T ótima.

56 INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA Enzimas PM cadeia polipeptídica e pontes dissulfeto = estáveis ao calor; Efeito da T = ph, força iônica e a presença ou ausência de ligantes; Substratos protegem a enzima da desnaturação.

57 INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA K é função da T Lei de Arrhenius A influência da temperatura na constante de velocidade k, obedece a lei Arrhenius k = k 0 e α RT

58 INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA Enzimas são termolábeis reação enzimática = inativação términa = k ' 0 β RT Efeito da T na velocidade das reações coeficiente de temperatura e Velocidade quando a T 0ºC. k ' 2,3 R T2 T logq0 = 0 O Q 0 (coeficiente de temperatura) representa o fator pelo qual a velocidade das reações enzimáticas (ou de outro processo biológico) vem multiplicada em consequência de um acréscimo de temperatura de 0 C. O Q 0 das reações enzimáticas situa-se entre e 2. E a