Diagrama mostrando a Anidrase carbónica II. A esfera cinza é um ion de zinco que funciona como cofator no sítio ativo.

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1 CINÉTICA ENZIMÁTICA Diagrama mostrando a Anidrase carbónica II. A esfera cinza é um ion de zinco que funciona como cofator no sítio ativo.

2 CINÉTICA ENZIMÁTICA

3 CINÉTICA ENZIMÁTICA ENZIMAS Amilases (hidrolase) APLICAÇÃO:EFEITOS Panificação, massas e biscoitos:modificação da massas; Cerveja:preparação do mosto; Álcool e Bebidas destiladas:sacarificação; Auxiliar Digestivo; Amido Modificado para Alimentos. FONTE Fungos Malte Malte Malte, Pâncreas Malte, Fungos Proteases (hidrolase) Panificação, massas e biscoito:modificação da viscosidade e textura da massa; Cerveja:estabilidade ao frio; Lavagens e Limpeza: remoção de manchas; Papaína, Bromelina Papaína, Pepsina Bactérias, Fungos, Pâncreas Peles e Couros: remoção da elastina Carnes: amaciamento Queijos: formação da coalhada, flavorizante Alimentos Proteicos: obtenção de hidrólisados Bactérias, Fungos, Pâncreas Papaína, Bromelina Renina, Fungos Bactérias, Pâncreas

4 CINÉTICA ENZIMÁTICA ENZIMAS Pectinases (hidrolase) Lipases (hidrolase) Glicose Oxidase (oxido-redutase) Catalase (oxido-redutase) Lipoxidade (oxido-redutase) Glicose-isomerase (isomerase) APLICAÇÃO:EFEITOS Frutas: clarificação dos sucos Vinhos: Clarificação, Filtração Lavagens, limpezas: remoção de manchas; Queijos: flavorizantes Alimentos: remoção de oxigênio FONTE Fungos Fungos Pâncreas, Fungos Fungos Fungos Remoção de H 2 O 2 : alvejante, bactericida Fungos, Fígado Panificação: alvejante Xarope de alto teor de frutose Farinha de Soja Bactérias, Fungos

5 Enzimas são proteínas (seqüência de aminoácidos) com peso molecular muito grande, e com propriedades catalíticas. Na maioria das vezes são proteínas globulares. É mostrado na tabela 2 uma comparação entre as características das enzimas e dos catalisadores inorgânicos. Comparação entre as enzimas e os catalisadores inorgânicos. CARACTERÍSTICA ENZIMAS 1 Especificidade ao substrato Alta 2 Natureza da estrutura Complexa 3 Sensibilidade à temperatura Alta 4 Condições de reação (T, P e ph) Suaves 5 Custo de obtenção (isolamento e purificação) Alto 6 Natureza do processo Batelada/contí nuo 7 Consumo de energia Baixo 8 Formação de subprodutos Baixa 9 Reutilização do catalisador Simples/cara 10 Atividade catalítica (temperatura ambiente) Alta 11- Presença de cofatores Sim 12 Energia de ativação Baixa CATALISADORES QUÍMICOS Baixa Simples Baixa Drásticas (geralmente) Moderado Batelada/contínuo Alto Alta Simples Baixa Não Alta 13 Velocidade de reação Alta Baixa

6 A característica mais importante das enzimas é a elevada especificidade; Muitas enzimas possuem um grupo limitado de substratos; mas outras possuem uma especificidade absoluta para um único substrato como mostrado na Figura 1: Substrato Produtos Sítio ativo Enzima Enzima E + S ES E + P

7 NOMENCLATURA nome do substrato ou + sufixo ase reação que catalisa protease (hidrolisa proteínas) álcool desidrogenase (catalisa a desidrogenação de um álcool) outras apresentam terminações ina (tripsina, renina, bromelina etc)

8 CINÉTICA ENZIMÁTICA

9 CINÉTICA ENZIMÁTICA A linha em vermelho representa a reação na ausência de catalisador; A linha em azul na presença de enzima. S: nível de energia do(s) substrato(s); P: nível de energia do(s) produto(s); G: energia de Gibbs; R: coordenada de reação (sentidos de progressão de reação); ΔG'º: energia livre padrão bioquímica; ΔG : energia de ativação S-P: do(s) substrato(s); P-S: do(s) produto(s)).

10 A cinética enzimática é o estudo do mecanismo pelo qual as enzimas se ligam aos substratos, transformando-os em produtos. São utilizados dados sobre a velocidade de reação de enzimas através de ensaios enzimáticos. Mecanismo de reação de uma enzima com substrato único. A enzima (E) liga o substrato (S) e liberta o produto (P).

11 Cinética de Michaelis Menten Curva de saturação para uma enzima mostrando a relação entre a concentração do substrato e a velocidade de reação; As reações catalisadas por enzimas são saturáveis, e a sua velocidade de catálise não indica uma resposta linear face ao aumento de substrato. Se a velocidade inicial da reação é medida sobre uma escala de concentrações de substrato [S]); a velocidade de reação (v), aumenta com o acréscimo de [S]. A medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o valor máximo V max.

12 CINÉTICA ENZIMÁTICA A saturação acontece porque, à medida que aumenta a concentração de substrato, aumenta também a quantidade de enzima na forma do complexo enzimasubstrato (ES). À velocidade máxima (V max ), todos os centros ativos estão ocupados (saturados) com substrato, ou seja, não existe enzima livre para ligar mais substrato; A concentração do complexo (ES) é igual à concentração de enzima.

13 CINÉTICA ENZIMÁTICA A atividade de uma enzima é geralmente descrita através de (V max ) e também da constante de Michaelis-Menten (K M ), que representa a concentração do substrato detectado a uma velocidade de reação igual a metade de (1/2*V max ) Cada enzima possui um K M característico (k cat ) para um dado substrato; este parâmetro é muitas vezes usado para demonstrar a força de ligação de um substrato à enzima. É também usada outra constante cinética, k cat, para descrever o comportamento de uma enzima, representando o número de moléculas de substrato que podem ser catalisadas por centro ativo por segundo.

14 CINÉTICA ENZIMÁTICA. Enzima Substrato Catalase H 2 O 2 25 Hexoquinase Glutamato Desidrogenase Aspartato aminotransferase Glicose Frutose Glutamato Alfa-cetoglutarato Amônica Aspartato Alfa-cetoglutarato Oxalacetato Glutamato K m (mm) 0,15 1,5 0,12 2,0 57 0,9 0,1 0,04 4,0

15 No modelo da cinética de Michaelis-Menten de uma reação com um substrato existe uma reação bimolecular inicial entre a enzima E e o substrato S para formar o complexo ES. Embora o mecanismo enzimático para a reação unimolecular possa ser bastante complexo, há tipicamente um passo na determinação da velocidade que permite que se modele o mecanismo como um passo catalítico simples de velocidade constante k 2. (Eq. 1). k 2 também é o valor máximo de reações enzimáticas catalisadas por segundo.

16 Com baixas concentrações de substrato [S], a enzima permanece em equilíbrio entre a forma livre E e o complexo enzima-substrato ES; Aumentando [S] aumenta [ES] à custa de [E], mudando o equilíbrio para o lado direito. Uma vez que a velocidade de reação depende da concentração [ES], a velocidade é sensível a pequenas alterações de [S]; Altos valores de [S], a enzima fica totalmente saturada com substrato, e existe apenas na forma ES. Nestas condições, a velocidade (v k 2 [E] tot =V max ) é insensível a pequenas alterações de [S]; assim, [E]tot é a concentração total enzimática que é aproximadamente igual à concentração [ES] em condições de saturação.

17 A equação de Michaelis Menten[7] descreve como a velocidade de reação v depende da posição do equilíbrio ligado ao substrato e da constante de velocidade k 2. Michaelis e Menten mostraram que se k 2 for bem menor que k -1 (chamada a aproximação de equilíbrio), pode obter-se a seguinte equação: A constante de Michaelis Km é definida como a concentração para a qual a velocidade da reação enzimática é a metade de Vmax. Isto pode verificar-se ao substituir Km = [S] na equação de Michaelis- Menten. Se o passo para determinação da velocidade for lento, quando comparado com a dissociação do substrato (k2 << k-1), então a constante de Michaelis Km é aproximadamente à constante de dissociação do complexo ES, embora tal situação seja relativamente rara.

18 A situação mais normal dá-se quando k 2 > k -1 as vezes chamada como cinética de Briggs-Haldane; A equação ainda se verifica em condições mais gerais, como provém da aproximação ao estado estacionário; Durante o período inicial, a velocidade de reação v é relativamente constante, indicando que [ES] é também aproximadamente constante (cf. equação 1): A concentração de [ES] é dada por: em que a constante de Michaelis Km é definida por:

19 [E] é a concentração de enzima livre);. Em conjunto, a fórmula geral para a velocidade de reação v vem pela equação de Michaelis-Menten: A constante de especificidade k cat / K m é uma medida da eficiência de conversão pela enzima do substrato em produto. Usando a definição da constante de Michaelis K m, a equação pode ser escrita na forma:

20 O gráfico de velocidade face a [S] não é linear. Embora a baixas concentrações de substrato se mantenha linear, vai curvando à medida que aumenta a concentração de substrato. Antes da chegada dos computadores, que permitem ajustar regressões não lineares de forma simples, podia chegar a ser realmente difícil estimar os valores de K m e V max nos gráficos não lineares. Então vários pesquisadores concentrassem os seus esforços em desenvolver métodos de linearização da equação de Michaelis- Menten, dando como resultado o gráfico de Lineweaver-Burke

21 O gráfico de Lineweaver-Burk ou representação de duplo recíproco é a forma mais comum, e simples,de mostrar os dados da cinética enzimática. Para tal, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equação de Michaelis-Menten. Como se pode ver na figura, o resultado deste tipo de representação é uma linha reta cuja equação é a da reta, sendo o ponto de interceção entre a reta e o eixo das ordenadas equivalente a 1/V max, e o ponto de intercepção entre a reta e o eixo de abcissas equivalente a -1/K m. O gráfico de Lineweaver-Burke mostra o significado dos pontos de interceção entre a reta e os eixos de ordenadas, e do gradiente da velocidade.

22 INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Esquema cinético para inibidores enzimáticos reversíveis. E=Enzima; S=Substrato; ES=Complexo; P=Produto; I=Inibidor

23 FATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICA [P] Produto e [S] Substrato Tempo

24 FATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Influência da Concentração da Enzima [P] [E] 1 [E] 2 [E] 1 >[E] 2 >[E] 3 >[E] 4 [E] 3 [E] 4 Tempo

25 FATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Influência da Concentração de Substrato O modelo cinético de Michaelis e Menten é utilizado para explicar matematicamente a influência da concentração do substrato na cinética da reação enzimática. Essa teoria admite que inicialmente, a enzima e o substrato reagem reversívelmente, formando um composto intermediário denominado complexo enzima-substrato que por sua vez decompõe ou regenera a enzima e forma os produto da reação. k1 E + S ES k2 k3 ES E + P V onde k1 = constante de velocidade de formação do complexo k2 = constante de velocidade de dissociação do complexo k3 = constante de velocidade de decomposição do complexo formando os produtos da reação V = velocidade de formação dos produtos

26 Consideremos um caso simples, caracterizado pelas seguintes hipóteses: a) Complexo ES (1mol de enzima para 1 mol de substrato) b) O complexo formado se decompõe, sem reagir com outras substâncias existentes no sistema c) Fazendo X = ES logo a variação da concentração de X com o tempo (dx/dt) será: dx/dt = k 1.E.S k 2 X k 3 X eq. 01 fazendo Et = E + X logo E = Et X fazendo St = S + X logo S = St X onde St = quantidade de substrato total adicionada ao sistema S = quantidade de substrato não associada ao complexo ES Et = quantidade de enzima total adicionada ao sistema E = quantidade de enzima não associada ao complexo ES

27 Substituindo os valores de E e de S na eq. 01 vem: dx = k1( Et X)( St X) k2x k3x dt eq. 02 supondo que as concentrações de substrato são muito maiores que as de enzima e portanto muito maiores que as do complexo, o que é comum na prática ES<<S>>E Então pela eq. 02 vem: dx eq. 03 dt = k1 ( Et X) St ( k2 + k3) X

28 Supondo, ainda que boa parte da reação se desenvolve mantendo-se constante a concentração do complexo no tempo (estado estacionário) ou seja dx/dt = 0 k St ( Et X ) = ( k2 k3) X 1 + X = k1st ( Et k2 + k3 X) k 1 X = S t ( E t X) ( k2 + k3) / k1 = S t E t S t X km

29 k2 + k onde k 3 m = = constante de Michaelis e k 1 Menten que pode indicar o grau de afinidade da enzima pelo substrato, ou seja, quanto maior a afinidade da enzima pelo substrato menor é o valor de km isolando X S t X X + = k m S t E t k m 1 + St X = k m StEt k m X = StEt km St km X = StEt 1. km + km St km S t E X = t. k m k m k m S t ( + ) X = S t E t km + St

30 fazendo St = S e Et = E vem, X km SE = eq S Sabendo que a velocidade da reação enzimática é V = K 3 X eq. 05 Substituindo a eq. 04 na eq. 05 vem, V k ES = 3 k m + S Fazendo K 3 E = Vmax = Velocidade máxima de formação de produtos correspondente a situação em que toda enzima se encontra na forma ES vem: V S = Vmax k m + S eq. 06 Esta equação é chamada equação de Michaelis e Menten.

31 V = Vmax k m S + S Vmax (2) (3) Vmax/2 (1) k m S Na região (1) do gráfico a velocidade da reação é uma função crescente da concentração do substrato, até um determinado valor desta concentração (ponto 2) que a partir do qual a velocidade se mantém constante (região 3). O tipo desta curva é análogo aos fenômenos de saturação que pode ser melhor compreendido analisando o próximo gráfico.

32 Situação antes do Equilíbrio Situação no Equilíbrio % da V max E S E + S ES 25% 50% 75% 100% 100%

33 Quando a concentração do substrato é tal que a velocidade de reação é metade da velocidade máxima teremos: 1 2 = K [S] m + [S] Km + [S] = 2[S] Km = [S] Como se sabe o valor de K m é inversamente proporcional a afinidade da enzima pelo substrato. Desta forma podemos comparar a afinidade da Enzima1 com a da Enzima2 no gráfico: Vmax Vmax/2 Km1 Km2 K m2 > K m1 portanto, a afinidade da enzima1 pelo substrato S é maior que a da enzima2 Enzima1 Enzima2 S

34 A forma precisa de determinar V max e k m a partir de dados experimentais é pela equação de Lineweaver-Burk; Resultado da inversão da equação 4 de Michaelis e Menten, como já visto anteriormente: eq V = 1 Vmax + km Vmax 1. S

35 que trata-se da equação de uma reta representada pela figura a seguir. 1/v km/vmáx 1/v MAX 1 v 1 = vmax + km Vmáx * 1 S 1/S

36 ATIVIDADE ENZIMÁTICA A velocidade da reação pode também ser expressa em termos de sua atividade enzimática, que é a quantidade de produto formado em um certo tempo pela quantidade de enzima utilizada. A atividade de uma enzima é definida especificamente para cada caso estudado. A CONSTANTE CATALÍTICA é definida para se estudar a eficiência da catálise enzimática. k cat = V max [E]

37 k equivale ao número máximo de cat moléculas de substrato que um centro ativo converte em produto por segundo; Como exemplo, podemos tomar a enzima catalase com k = 10 7 s -1 ; cat portanto esta enzima é capaz de originar moléculas de produto por segundo.

38 FATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Influência da Concentração de Substrato A inibição enzimática pode ser reversível ou irreversível O inibidor irreversível forma um complexo estável com a enzima não podendo ser removido para recuperar a enzima ativa. Exemplo: : metais pesado (Hg), agentes complexantes de metais (CN) A inibição reversível é caracterizada por uma constante de equilíbrio k i, que é medida pela afinidade do inibidor com a enzima. Três formas simples de inibição podem ser descritas: Pelo substrato (reversível) Competitiva (reversível) Não competitiva (irreversível)

39 FATORES DE INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Influência da Concentração de Substrato Inibidores enzimáticos são moléculas que reduzem ou eliminam a atividade das enzimas. Podem ser de dois tipos: Reversíveis: quando a remoção do inibidor restaura a atividade enzimática; classificados como competitivos, acompetitivos, não-competitivos e mistos, segundo o efeito que produzam nas constantes cinéticas K m e V max. Este efeito dependerá da união do inibidor à enzima E, ao complexo enzima-substrato ES ou a ambos. Irreversíveis: quando o inibidor inativa de modo permanente a enzima. Geralmente produzem modificações covalentes de resíduos do centro catalítico da enzima. Estas reações decaem de forma exponencial e são habitualmente saturáveis. Abaixo dos níveis de saturação, mantêm uma cinética de primeira ordem em relação ao inibidor.

40 INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Esquema cinético para inibidores enzimáticos reversíveis.

41 Influência do Excesso de Substrato k 1 E + S ES k 2 k 3 ES + S ES2 (Complexo não reativo) k 4 k 5 ES E + P V V Vmax V = eq. 08 VmaxS S 2 km + S + k i onde ki é a constante de inibição; S Para encontrar as constantes faz-se a inversão segundo Lineweaver-Burk

42 1 V = 1 Vmax + km Vmax 1. S + 1 VmaxKi X S Eq. 9 1ª Hipótese: para valores de S<<ki a eq. 09 se reduz em, 1 V = 1 Vmax + k m Vmax 1. S 1/V K m /v max -1/k m 1/S

43 1 V = 1 Vmax + km Vmax 1. S X + 1 VmaxKi S Eq. 9 2ª Hipótese: para valores de S>>k m a eq. 09 se reduz em, 1 V = 1 Vmax + 1 VmaxKi S 1/V 1/v max K i 1/V max S Os valores de V max determinados em ambos os gráficos devem ser próximos.

44 Diz-se que um inibidor competitivo reage com a enzima como se fosse um outro substrato. Indicando-se com Ι a fórmula molecular de um inibidor competitivo, a teoria de Michaelis e Menten fornece: k 1 k 3 E + S ES ES E + P k 2 V k 4 E + Ι EΙ EΙ E + P k 5 k 6

45 INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Esquema cinético para inibidores enzimáticos reversíveis.

46 O complexo EΙ E (Enzima-Inibidor) pode ou não formar produto, porém quando o inibidor forma o complexo EΙ E fica impedindo que o substrato S entre em contato com a enzima E. A velocidade de formação do produto desejado será, então: S eq. 10 Vi = Vmax k m (1 + Ι / k i ) + onde k m = (k 2 +k 3 )/k 1 = cte de Michaelis e Menten Ι = concentração do Inibidor k i = (k 5 +k 6 )/k 4 Invertendo a equação segundo Lineweaver-Burk S

47 1 1 km(1 + Ι / ki) 1 +. V i Vmax Vmax S = Eq.11 1/V I 2 >I 1 I 1 I=0 1/V max = -1/k m 1 1/S km(1 + Ι / ki)

48 Fazendo a relação entre Velocidade segundo Michaelis e Menten e a Velocidade de inibição competitiva vem; V V i = 1 + k m Ι ( k m + S) K i Eq.12

49 Esta relação trata-se de uma representação matemática da influência das concentrações de substrato e de inibidor na inibição competitiva, da seguinte forma: V/V I S 2 <S 1 S 1 1 S>>i Ou seja, com o aumento da concentração de substrato em relação a concentração do inibidor diminui a influência do inibidor na cinética enzimática. I

50 INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA (irreversível) Consideremos o caso em que o inibidor, presente no sistema na concentração Ι,, bloqueia irreversivelmente uma concentração αι de enzima. Teremos então: k 1 E + S ES E + P k 2 V i k3 k 4 E+Ι EΙ A velocidade de formação do produto desejado será: S V i = ( Vmax k3α Ι ) Km + S eq. 13 onde Ι = Concentração do inibidor αι = porção de enzima bloqueada irreversivelmente

51 Invertendo a equação segundo Lineweaver-Burk vem: 1 Vi = 1 km 1 +. Vmax k3α Ι Vmax k3α Ι S eq. 14 1/V i I 2 >I 1 1 Vmax k3 α Ι I 1 I=0 = -1/k m 1/S