Departamento de Bioquímica. Instituto de Química USP EXERCÍCIOS BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL QBQ 0316N. Professores. Carlos Takeshi Hotta

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1 Departamento de Bioquímica Instituto de Química USP EXERCÍCIOS BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL QBQ 0316N 2013 Professores Carlos Takeshi Hotta Guilherme Menegon Arantes 1

2 1. O ácido dinitrosalicílico (DNS) pode ser usado para medir a quantidade de açúcares redutores em amostras, pois a reação deste com o grupo aldeído livre presente no carbono 1 das aldoses, ou com o grupo cetônico presente em frutoses, libera um produto que absorve luz à 540 nm. Alunos de um curso de bioquímica, montaram a seguinte curva padrão usando uma solução de glicose 5 mm (massa molar = 180 g) e obtiveram os seguintes resultados após ferver as amostras por 10 min: Glicose 5 mm Água Reagente DNS Massa de glicose (µg) 540 nm , , , , , , , , , , ,220 O reagente da Glicose Oxidase (TGO) pode ser usado para medir especificamente a quantidade de glicose presente em uma amostra. A glicose oxidase, ao oxidar glicose, reduz um grupo NAD + para NADH. Essa reação pode ser acoplada à oxidação de um grupo como a o-dianisidina, a qual passa a absorver luz a 420nm ao ser oxidado. Foi montada uma curva padrão com uma solução de glicose 0,5 mm e, após incubar a amostra por 1 h a 37 C para ocorrer a reação foram obtidos os seguintes resultados: Glicose 0,5 mm Água Reagente TGO Massa de glicose (µg) 420 nm , , , , , , , , , , ,980 O reagente Fenol-Sulfúrico (FS) pode ser usado para medir a quantidade de açúcares presentes em uma amostra, pois após a hidrólise pelo ácido sulfúrico e a reação do fenol com os grupos hidroxila é gerado um produto que absorve a 490 nm. Foi montada a curva padrão abaixo com uma solução de glicose 1 mm e após a reação foram obtidos os dados abaixo: 2

3 Glicose 1 mm Água Reagente FS Massa de glicose (µg) 490 nm Diferentes variedades de cana-de-açúcar foram testadas para saber qual das variedades possui a maior quantidade de açúcares solúveis, o que é de grande interesse para a indústria açucareira. Pedaços do colmo da cana-de-açúcar foram homogenizados em água e este material foi centrifugado por 10 min a g a 4 C. O sobrenadante foi diluído é usado para determinação de açucares com os métodos do ácido dinitrosalícilico (DNS), glicose oxidase (TGO) e fenol-sulfúrico (FS). Os resultados estão expostos na tabela abaixo: Variedade Massa de tecido (g) Volume final (ml) Diluição (X) Amostra 540 nm (DNS) 420 nm (TGO) 490 nm (FS) ,001 0,003 0, ,005 0,001 1, ,003 0,002 1, ,002-0,009 0, ,010 0,001 0, ,000 0,007 1, ,001-0,008 1, ,003-0,001 1, ,002 0,001 1, ,008 0,002 1,487 a) Qual das técnicas é a melhor para esse teste? Como você explicaria esses resultados? b) Calcule a concentração de açúcares solúveis nos diferentes homogeneizados e a quantidade de açúcar que pode ser obtida por grama de tecido vegetal. Qual das plantas é a melhor para a produção de sacarose? c) Uma indústria farmacêutica está interessada na produção de alfa-glicosidase de levedura para geração de glicose e frutose a partir de açúcar da cana (sacarose). Para tal, obteve várias linhagens de levedura e agora há a necessidade de medir a atividade de alfa-glicosidase presente nas células. Quais das técnicas DNS, TGO ou FS você usaria para medir a atividade dessa enzima, usando sacarose como substrato? 2. A indústria farmacêutica preparou lisados de levedura de diferentes linhagens. Em todas as amostras usou 1 g de células e obtiveram 10 ml de lisado. Esses lisados foram utilizados para ensaios enzimáticos, empregando p-nitrofenil α-glicosídeo (pnpαglc) como substrato. Foram obtidos os resultados a seguir: 3

4 linhagem diluição lisado diluído água pnpαglc 420 nm (15 min) 420 nm (30 min) 420 nm (45 min) 420 nm (60 min) A 100x ,050 0,100 0,150 0,200 B 50x ,080 0,160 0,240 0,320 C 8x ,250 0,500 0,750 1,000 D 70x ,100 0,200 0,300 0,400 E 500x ,010 0,020 0,030 0,040 F 200x ,075 0,150 0,225 0,300 As mesmas amostras foram submetidas à determinação de proteínas com o reagente de Bradford (comassie blue G), obtendo-se os dados a seguir: linhagem diluição lisado diluído água Reagente Bradford (ml) 595 nm (15 min) A 20x ,265 B 50x ,320 C 10x ,50 D 20x ,105 E 5x ,750 F 80x ,415 Confeccionou-se também uma curva padrão usando albumina de ovo: Albumina 0,2 g/l água Reagente Bradford (ml) Massa de proteína (mg) 595 nm (15 min) , , , , , , , , , , ,800 Calcule a concentração de atividade enzimática no lisado de cada uma das linhagens de levedura. Calcule também a atividade obtida por grama de células. Calcule a concentração de proteína em cada um dos lisados e a atividade específica de cada um dos materiais. Se o próprio lisado for utilizado industrialmente como fonte de enzima, qual das linhagens é melhor para produzir essa enzima em larga escala? Se for necessário purificar a enzima, qual das linhagens é a melhor fonte? Justifique as respostas. 4

5 3. Um homogeneizado do epitélio do tubo digestivo de rato apresenta atividade da enzima alfaglicosidase. Para as condições de preparação deste homogeneizado obteve-se uma atividade enzimática de 80 mu/ml e uma atividade específica de 80 mu/mg. A fim de purificar esta alfa-glicosidase, 1,5 ml deste homogeneizado foram submetidos a uma cromatografia de troca iônica em uma coluna DEAE-celulose e obteve-se o seguinte perfil de atividade de alfa-glicosidase nos tubos coletados durante a cromatografia: Os tubos com maior atividade de alfa-glicosidase foram reunidos. Este material com volume de 1,0 ml foi denominado DEAE. Em seguida, o DEAE foi utilizado para determinação de atividade enzimática e concentração de proteína total. As condições do ensaio de atividade enzimática e os resultados obtidos estão descritos na tabela abaixo: p-nitrofenil α- glicosídeo 4mM DEAE Tempo de incubação a 30 o C (min) 420 nm , , , ,4 Nas condições de ensaio de atividade de alfa-glicosidase descritas acima, a curva padrão utilizada para cálculo da atividade enzimática tem a equação 420 = 0,0056 nmols. As condições utilizadas para determinação da concentração de proteína total estão descritas na tabela abaixo: DEAE Água Reagente Bradford 595 nm , , , ,350 A curva padrão do reagente de Bradford preparada nas mesmas condições de volume que a tabela acima está apresentada a seguir: 5

6 Utilizando estas informações e resultados, determine: a) a concentração de atividade enzimática (mu/ml) do DEAE b) a concentração de proteína total (mg/ml) do DEAE c) a atividade específica do DEAE d) a recuperação de atividade enzimática após a cromatografia de troca iônica e) o enriquecimento da atividade enzimática após a cromatografia de troca iônica Obs: 1 mu (miliunidade) de atividade enzimática corresponde à quantidade de enzima que catalisa uma reação química com a velocidade de formação de 1 nmol de produto/minuto. 4. O gráfico abaixo representa a atividade enzimática de alfa-glicosidase eluída em uma cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-celulose. Sabendo que o ponto isoelétrico (pi) desta enzima é 7,0 e que esta cromatografia foi feita em tampão ph 8, construa um esboço do gráfico esperado para cromatografias realizadas em ph 9,0 e ph 4,0. Estes esboços devem indicar o ponto de eluição da atividade enzimática em relação ao gradiente de NaCl. 6

7 5. As figuras a seguir apresentam o perfil de eluição da atividade de alfa-glicosidase em uma cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-celulose. Cada uma das cromatografias foi realizada utilizando um tampão com ph diferente (9,0 8,0 6,0). Com base nos resultados responda qual a provável faixa de valores do pi (ponto isoelétrico) desta alfa-glicosidase: 6. Você conseguiu purificar uma celulase através da marcha de purificação a seguir. 1º passo: cromatografia de troca aniônica em ph 10. 2º passo: cromatografia de filtração em gel em ph 6,0. 7

8 Após cada passo os tubos que continham a atividade de celulase foram reunidos. Para este material foi calculada a atividade enzimática total de celulase e também a quantidade de proteína. A tabela abaixo resume estes resultados: Passo Atividade de celulase aplicada (U) Atividade de celulase recuperada (U) Proteína total aplicada (mg) Proteína total recuperada (mg) Troca iônica ,0 0,05 Filtração em gel ,05 0,02 Após cada cromatografia os tubos que continham atividade de celulase também foram reunidos e analisados por SDS-PAGE: SDS-PAGE de materiais recolhidos ao longo da marcha de purificação. M meio de cultura; T material recuperado após cromatografia de troca aniônica; F material recuperado após cromatografia de filtração em gel; P padrões de peso molecular. Para a coluna de filtração em gel de 25 ml usada na marcha de purificação foi previamente preparada uma curva de calibração utilizando proteínas de diferentes pesos moleculares. Os dados obtidos estão descritos na tabela abaixo juntamente com o resultado para cromatografia da celulase: Material Volume de eluição (ml) Proteína padrão de daltons 7,53 Proteína padrão de daltons 9,38 Proteína padrão de daltons 10,46 Proteína padrão de daltons 13,70 Proteína padrão de daltons 16,22 Atividade celulásica 9,58 a) Calcule a recuperação da atividade enzimática após cada um dos passos da purificação da celulase. b) Calcule a atividade específica da celulase após cada um dos passos da marcha de purificação. c) Qual dos passos é melhor na purificação desta enzima? Por quê? d) Calcule a massa molecular da enzima determinada por SDS-PAGE e por filtração em gel. Compare os valores e formule hipóteses para explicar os resultados. 8

9 7. Um bioquímico recebeu uma amostra para análise. Nela, havia diversas proteínas que precisavam ser separadas umas das outras. Numa primeira etapa, o bioquímico utilizou uma coluna de gel filtração recomendada para proteínas de alto peso molecular (> 60 kda) e obteve o seguinte perfil de eluição: 8. Perfil da cromatografia de gel filtração em Superdex-200. As proteínas separadas foram coletadas nos tubos 1, 2, 3 e 4. Os volumes aproximados de eluição para cada tubo foram: Tubo 1 = 10 ml Tubo 2 = 11 ml Tubo 3 = 13 ml Tubo 4 = entre 14,5 e 15 ml Volumes aproximados (+/- 0,5 ml) Usando essa mesma coluna de gel filtração (volume total de 25 ml), nas mesmas condições da corrida anterior, o bioquímico analisou os padrões de peso molecular, obtendo os seguintes resultados: Material Volume de eluição (ml) Proteína padrão de kda 7,53 Proteína padrão de 250 kda 9,38 Proteína padrão de 170 kda 10,46 Proteína padrão de 65 kda 13,70 Proteína padrão de 24 kda 16,22 Atividade celulásica 9,58 Os tubos marcados de 1 a 4 foram então analisados por SDS-PAGE em condições redutoras e não redutoras, sendo obtido o seguinte perfil: 9

10 Eletroforese de SDS-PAGE em condições redutoras (c/β-mercaptoetanol) e não redutoras das proteínas contidas nos tubos 1, 2, 3 e 4. No último poço, encontram-se os padrões de pesos moleculares. Após analisar os dados, o bioquímico então decidiu submeter a amostra do tubo 4 a uma cromatografia de troca de ânions (-) em ph 7, seguida de eletroforese SDS-PAGE das frações obtidas. Os resultados da cromatografia e da eletroforese estão na figura abaixo: Responda: a) Quantas proteínas estavam presentes na amostra? b) Qual o peso molecular de cada uma delas? Quais continham mais de uma subunidade e qual o peso molecular de cada cadeia proteica? c) Qual o pi aproximado de cada proteína do tubo 4 (maior, menor ou próximo de 7)? 8. Para uma alfa-glicosidase foram determinadas as velocidades de hidrólise de diferentes concentrações de substrato (NpαGlc) na presença de diferentes concentrações de um inibidor. Estes dados estão apresentados na tabela abaixo. Baseando-se nesta tabela determine o Vmax e o Km para a hidrólise do substrato e o Ki para este inibidor. 10

11 [S](mM) V (nmol/min) [I](mM) ,10 0,91 0,48 0,32 0,24 0,20 0,20 1,67 0,91 0,63 0,48 0,38 0,30 2,31 1,30 0,91 0,70 0,57 0,40 2,86 1,67 1,18 0,91 0,74 0,50 3,33 2,00 1,43 1,11 0,91 0,75 4,29 2,73 2,00 1,58 1,30 1,00 5,00 3,33 2,50 2,00 1,67 1,50 6,00 4,29 3,33 2,73 2,31 2,00 6,67 5,00 4,00 3,33 2,86 2,50 7,14 5,56 4,55 3,85 3,33 4,00 8,00 6,67 5,71 5,00 4,44 6,00 8,57 7,50 6,67 6,00 5,45 8,00 8,89 8,00 7,27 6,67 6,15 10,00 9,09 8,33 7,69 7,14 6,67 9. O tecido embrionário de fígado contém uma enzima que catalisa a reação S -> P. O tecido de fígado adulto também apresenta a atividade S -> P. Alguns dados cinéticos obtidos com extratos dos dois tecidos são apresentados abaixo. Que conclusões você pode tirar com relação à identidade das duas enzimas? [S] Velocidade inicial observada (µmoles.mg de proteína -1.min -1 ) [M] Extrato de Fígado Adulto (E1) Extrato de Fígado Embrionário (E2) 1,67 x ,05 5,00 2,50 x ,54 6,66 3,33 x ,98 8,00 5,00 x ,86 10,00 7,00 x ,78 11,67 1,00 x ,00 13,33 1,50 x ,67 15,00 1,67 x ,15 15,40 2,00 x ,00 16,00 3,00 x ,00 17, Durante danos consideráveis do fígado, uma enzima (E1 do Probl. 9) é liberada na corrente sanguínea. Após exercícios intensos, uma enzima de músculo, E3, que catalisa a mesma reação, é liberada na corrente sanguínea. E1 e E3 podem ser diferenciadas facilmente porque apresentam diferentes valores de Km (A Km da enzima de músculo é 2 x 10-5 M.) Uma determinação com uma amostra de sangue de um paciente apresentou os resultados dados na tabela abaixo: [S](M) V (moles.ml de soro -1.min -1 ) 5,0 x ,0 x ,0 x ,5 x ,0 x ,0 x ,0 x Sabendo que o paciente chegou inconsciente no hospital, de modo que você não pode fazer a ele nenhuma pergunta, o paciente sofre de uma doença do fígado, ou simplesmente tem se exercitado violentamente? 11