Departamento de Bioquímica Instituto de Química USP EXERCÍCIOS BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL QBQ 0316N Professores. Carlos T. Hotta Ronaldo B.

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1 Departamento de Bioquímica Instituto de Química USP EXERCÍCIOS BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL QBQ 0316N 2016 Professores Carlos T. Hotta Ronaldo B. Quaggio 1

2 1. Um extrato de proteínas foi obtido a partir da lise de leveduras. Para se quantificar a quantidade de proteínas neste extrato, foi utilizado o reagente de Bradford. Junto com suas amostras, duas curvas-padrão foram geradas medindo-se a Absorbância em 595 nm em amostras incubadas com o reagente de Bradford por 8 min. Os dados abaixo são das Absorbâncias subtraídas do Branco. a) Qual a função do Branco? b) Qual dos dois gráficos é mais adequado para se utilizar como uma curva-padrão? Justifique c) Qual a unidade de concentração de proteína que será obtida? d) Qual é a maior e a menor absorbância que a curva-padrão consegue medir com confiança? Qual é a concentração de proteínas nestas absorbâncias? e) Digamos que sua amostra teve uma absorbância de 1.7, a concentração obtida usando a curva-padrão é confiável? Como solucionar este problema? f) As absorbâncias abaixo foram obtidas com uma mesma amostra diluída em concentrações diferentes. Calcule a concentração da amostra sem diluir. g) Abs 595 nm Diluição 5x 1.8 Diluição 50x 1.25 Diluição 100x 0.64 Diluição 500x

3 2. A indústria farmacêutica preparou lisados de levedura de diferentes linhagens. Em todas as amostras usou 1 g de células e obtiveram 10 ml de lisado. Esses lisados foram utilizados para ensaios enzimáticos, empregando p-nitrofenil α-glicosídeo (pnpαglc) como substrato. Foram obtidos os resultados a seguir: linhagem diluição lisado diluído (µl) água (µl) pnpαglc (µl) Abs 420 nm (15 min) Abs 420 nm (30 min) Abs 420 nm (45 min) Abs 420 nm (60 min) A 100x ,050 0,100 0,150 0,200 B 50x ,080 0,160 0,240 0,320 C 8x ,250 0,500 0,750 1,000 D 70x ,100 0,200 0,300 0,400 E 500x ,010 0,020 0,030 0,040 F 200x ,075 0,150 0,225 0,300 Use a equação da reta Abs 420nm = 0,0049 [nmol p-nitrofenolato] + 0,014 (gráfico na apostila de protocolos). As mesmas amostras foram submetidas à determinação de proteínas com o reagente de Bradford (coomassie blue G), obtendo-se os dados a seguir: linhagem diluição lisado diluído (µl) água (µl) Reagente Bradford (ml) Abs 595 nm (15 min) A 20x ,265 B 50x ,320 C 10x ,50 D 20x ,105 E 5x ,750 F 80x ,415 Confeccionou-se também uma curva padrão usando albumina de ovo: Albumina 0,2 g/l (µl) água (µl) Reagente Bradford (ml) Massa de proteína (mg) Abs 595 nm (15 min) , , , , , , , , , , ,800 3

4 a) Calcule a concentração de atividade enzimática no lisado de cada uma das linhagens de levedura. b) Calcule a atividade obtida por grama de células. c) Calcule a concentração de proteína em cada um dos lisados e a atividade específica de cada um dos materiais. d) Se o próprio lisado for utilizado industrialmente como fonte de enzima, qual das linhagens é melhor para produzir essa enzima em larga escala? Justifique a resposta. e) Se for necessário purificar a enzima, qual das linhagens é a melhor fonte? Justifique a resposta. 3. O tecido embrionário de fígado contém a enzima que catalisa a reação S -> P. O tecido de fígado adulto também apresenta a atividade S -> P. Alguns dados cinéticos obtidos com extratos dos dois tecidos são apresentados abaixo. Que conclusões você pode tirar com relação à identidade das duas enzimas? [S] Velocidade inicial observada (µmoles.mg de proteína -1.min -1 ) [M] Extrato de Fígado Adulto (E1) Extrato de Fígado Embrionário (E2) 1,67 x ,05 5,00 2,50 x ,54 6,66 3,33 x ,98 8,00 5,00 x ,86 10,00 7,00 x ,78 11,67 1,00 x ,00 13,33 1,50 x ,67 15,00 1,67 x ,15 15,40 2,00 x ,00 16,00 3,00 x ,00 17,10 Durante danos consideráveis do fígado, esta enzima é liberada na corrente sanguínea. Após exercícios intensos, uma enzima de músculo, E3, que catalisa a mesma reação, é liberada na corrente sanguínea. E1 e E3 podem ser diferenciadas facilmente porque apresentam diferentes valores de Km (A Km da enzima de músculo é 2 x 10-5 M). Uma determinação com uma amostra de sangue de um paciente apresentou os resultados dados na tabela abaixo: [S](M) V (moles.ml de soro -1.min -1 ) 5,0 x ,0 x ,0 x ,5 x ,0 x ,0 x ,0 x

5 Sabendo que o paciente chegou inconsciente no hospital, de modo que você não pode fazer a ele nenhuma pergunta, o paciente sofre de uma doença do fígado, ou simplesmente tem se exercitado violentamente? 4. As figuras a seguir apresentam o perfil de eluição da atividade de alfa-glicosidase em uma cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE-celulose. Cada uma das cromatografias foi realizada utilizando um tampão com ph diferente (9,0 8,0 6,0). Com base nos resultados responda qual a provável faixa de valores do pi (ponto isoelétrico) desta alfa-glicosidase: 5

6 5. Você conseguiu purificar uma celulase através da marcha de purificação a seguir. 1º passo: cromatografia de troca aniônica em ph 10. 2º passo: cromatografia de filtração em gel em ph 6,0. Após cada passo os tubos que continham a atividade de celulase foram reunidos. Para este material foi calculada a atividade enzimática total de celulase e também a quantidade de proteína. A tabela abaixo resume estes resultados: Passo Atividade de celulase aplicada (U) Atividade de celulase recuperada (U) Proteína total aplicada (mg) Proteína total recuperada (mg) Troca iônica ,0 0,05 Filtração em gel ,05 0,02 Após cada cromatografia os tubos que continham atividade de celulase também foram reunidos e analisados por SDS-PAGE em meio redutor: SDS-PAGE de materiais recolhidos ao longo da marcha de purificação. M meio de cultura; T material recuperado após cromatografia de troca aniônica; F material recuperado após cromatografia de filtração em gel; P padrões de peso molecular. Para a coluna de filtração em gel de 25 ml usada na marcha de purificação foi previamente preparada uma curva de calibração utilizando proteínas de diferentes pesos moleculares. Os dados obtidos estão descritos na tabela abaixo juntamente com o resultado para cromatografia da celulase: 6

7 Material Volume de eluição (ml) Proteína padrão de daltons 7,53 Proteína padrão de daltons 9,38 Proteína padrão de daltons 10,46 Proteína padrão de daltons 13,70 Proteína padrão de daltons 16,22 Atividade celulásica 9,58 a) Calcule a recuperação da atividade enzimática após cada um dos passos da purificação da celulase. b) Calcule a atividade específica da celulase após cada um dos passos da marcha de purificação. c) Qual dos passos é melhor na purificação desta enzima? Por quê? d) Calcule a massa molecular da enzima determinada por SDS-PAGE e por filtração em gel. Compare os valores e formule hipóteses para explicar os resultados. 6. Quatro amostras (1 a 4) foram submetidas à eletroforese em poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) na presença e na ausência de beta-mercaptoetanol, resultando nos seguinte géis: As distâncias de migração das bandas das proteínas no gel estão colocadas nas tabelas abaixo. 7

8 Gel em condições redutoras Proteínas Padrão Distância (cm) azul de bromofenol 6,8 banda A 0,7 banda B 1,6 banda C 3,9 banda D 5,0 banda E 4,4 banda F 4,2 banda G 4,8 banda H 5,3 Gel em condições não-redutoras Proteínas Padrão Distância (cm) azul de bromofenol 6,8 banda I 0,7 banda J 1,4 banda K 1,6 banda L 2,9 banda M 4,2 banda N 4,8 banda O 5,3 A curva gerada pelas proteínas padrão pode ser encontrada abaixo: logpm y = x R² = migração relativa Responda: a) Qual a função do SDS no SDS-PAGE? b) Qual a razão das diferenças entre o gel com β-mercaptoetanol e sem β- mercaptoetanol? c) Qual o peso molecular de cada uma delas? Quais continham mais de uma subunidade e qual o peso molecular de cada cadeia proteica? 8