Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2009/2010. Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II Mestrado Integrado em MEDICINA 1º Ano

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1 Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2009/2010 Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II Mestrado Integrado em MEDICINA 1º Ano ENSINO PRÁTICO E TEORICO-PRÁTICO 7ª AULA PRÁTICA Determinação da percentagem de hemoglobina glicosilada por cromatografia de troca iónica

2 Determinação da percentagem de hemoglobina glicosilada (Hb A 1 c) por cromatografia de troca iónica A hemoglobina é uma proteína com funções importantes no organismo humano, nomeadamente no transporte de oxigénio e no tamponamento de iões hidrogénio. A hemoglobina presente no glóbulo vermelho de um adulto saudável é, na verdade, uma mistura heterogénea de hemoglobinas: HbA (cerca de 90%), HbA 2 (2,5%) e HbF (0,2%). A HbA é constituída por 4 cadeias polipeptídicas designadas por α 2 β 2, enquanto que na HbA 2 as cadeias são α 2 δ 2 e, na HbF são α 2 γ 2. A glicosilação de proteínas é particularmente importante na manutenção da integridade das membranas plasmáticas, facilitando a secreção da proteína para o espaço extracelular. Estas modificações estão, geralmente, sob um rigoroso controlo enzimático. Contudo, algumas proteínas podem ser glicosiladas, independentemente de qualquer reacção enzimática, sendo a modificação apenas dependente da presença da concentração de glicose livre. Uma dessas proteínas é a HbA, que pode ser glicosilada de modo não enzimático e de uma forma irreversível, no radical terminal de cada cadeia β, para formar glico-hemoglobina (HbA 1 ). A HbA 1 forma-se lenta e continuamente, de forma estável e irreversível, durante os 120 dias de vida do glóbulo vermelho (GV). É constituída por três fracções, separáveis por electroforese: HbA 1 a, HbA 1 b, HbA 1 c, sendo esta última a componente maioritária. Sabe-se, desde 1968, que a HbA 1 existe em quantidade anormalmente elevada nos GV de doentes diabéticos, reflectindo a presença de hiperglicémia persistente. O interesse da avaliação da HbA 1 c reside no facto de os seus níveis traduzirem o valor médio da glicémia das semanas anteriores, independentemente das flutuações diurnas, permitindo por isso um melhor controlo da glicémia na diabetes (Tabela 1). A cromatografia de troca iónica é uma das técnicas disponíveis para avaliar e quantificar os níveis de HbA 1 c. O método de eluição de proteínas por cromatografia de troca iónica é uma técnica de afinidade. Baseia-se na ligação das proteínas aos trocadores iónicos através de forças electrostáticas entre as cargas da superfície das proteínas e os grupos carregados dos trocadores. A fase estacionária é um adsorvente, uma resina com carga positiva ou negativa, à qual se ligam, por interacção iónica, as proteínas da mistura a separar. Estas proteínas são posteriormente eluídas por acção de um electrólito de carga contrária à da carga da resina e de carga igual à dos componentes da mistura a analisar. Estes são mais ou menos retardados durante a eluição em função da afinidade para a resina. 1

3 Esta técnica separa, assim, as proteínas com base na sua carga "net" e no seu comportamento ácido-base (Figura 1). No doseamento da HbA 1 c por cromatografia de troca iónica, é utilizada uma resina ("Bio- Rex 70") que contém grupos carboxílicos, sendo portanto um trocador catiónico. A HbA 1 c, sendo mais aniónica (menor densidade de carga positiva) do que as outras formas de hemoglobina, é a primeira a ser eluída quando utilizamos um tampão de fosfato de sódio como eluente. Neste caso, a fase estacionária é uma resina trocadora catiónica, que contém grupos carboxílicos (COO - ) aos quais se ligam os grupos da hemoglobina carregados positivamente. A eluição é feita com tampões de fosfato, contendo iões de sódio (catiões), de força iónica crescente, em que os iões Na competem com a hemoglobina pela ligação à resina. Uma vez que a hemoglobina glicosilada contém um menor número de cargas positivas relativamente à hemoglobina normal, especialmente a HbA 1 c, a ligação à coluna é menos eficiente e a eluição mais rápida. Por esta razão, a eluição a partir das colunas permite obter em primeiro lugar as hemoglobinas glicosiladas, de tipo HbA 1 (sendo a maior percentagem de HbA 1 c), e somente depois as hemoglobinas de tipo HbA e HbA 2. CROMATOGRAFIA DE TROCA IÓNICA Eluente - As proteínas catiónicas (carregadas positivamente) ligam-se à resina de cargas negativas - As proteínas aniónicas (carregadas negativamente) atravessam a resina de cargas negativas - Numa 2ª fase, as proteínas catiónicas são removidas da resina por um eluente de maior força catiónica. Figura 1- Esquema do processo de cromatografia de troca iónica (trocador catiónico). 2

4 Unidade Curricular de BIOQUÍMICA II, Mestrado Integrado em MEDICINA, 2009/2010 PROTOCOLO DE BANCADA - 7ª AULA PRÁTICA DETERMINAÇÃO DA PERCENTAGEM DE HEMOGLOBINA GLICOSILADA POR CROMATOGRAFIA DE TROCA IÓNICA Preparação do hemolisado: 1) Manter os reagentes e as colunas à temperatura ambiente (os melhores resultados são obtidos a o C; usa-se o factor de correcção de 1,15 para temperatura entre 18-20ºC e de 0,9 para 27-30ºC). 2) Num tubo de ensaio: pipetar 50 µl de sangue total e 200 µl de reagente de hemólise (reagente 1). Agitar. Deixar repousar durante minutos (agitar suavemente de vez em quando). Preparação da(s) coluna(s): 3) Posicionar um tubo bem lavado por baixo de uma coluna nova, remover a tampa e só depois separar a parte de baixo (esta ordem é importante porque evita a entrada de ar por baixo). 4) Assim que se inicie a saída do líquido da coluna, empurrar o pequeno disco até ficar em contacto com a parte superior da resina (o disco não deverá ser comprimido contra a resina). Separação e leitura de HbA 1C : 5) Após eluição total de todo o líquido, aplicar 50 µl de sangue hemolisado directamente sobre o disco; lavar as paredes da coluna com 200 µl do reagente 2 e deixar que a resina retenha esta solução. 6) Pipetar 2 ml do reagente 2 e descartar o líquido eluído. 7) Eluir com 4 ml do reagente 3 e colectar para um novo tubo (fracção HbA 1C ). 8) Medir a absorvância a 415 nm contra um tubo com água (branco) - a absorvância é estável durante pelo menos uma hora. Leitura da Hb TOTAL : 9) Pipetar num tubo de ensaio 12 ml de reagente 3 e 50 µl de sangue hemolisado. 10) Agitar bem e ler a absorvância da Hb TOTAL a 415 nm contra um tubo com água (branco) - a absorvância é estável durante pelo menos uma hora. 1

5 Cálculos: 11) Determinar a concentração de HbA 1C (em %) de acordo com a equação: DO HbA1C x V HbA1C % Hb glicosilada = x 100 DO HbTOTAL x V HbTOTAL Como o volume de HbA 1C (V HbA1C ) é de 4 ml, o volume de Hb TOTAL (V HbTOTAL ) é de 12 ml. A seguinte fórmula pode ser deduzida: DO HbA1C 100 % Hb glicosilada = x Valores de Referência: DO HbTOTAL 3 10) Valores da concentração de hemoglobina glicosilada (HbA 1C ): - Indivíduos normais: 4-6 % - Indivíduos diabéticos não controlados: > 8 % Tabela 1- Relação da HbA 1C e os valores médios de glicémia HbA 1C Glicémia mg/dl média mmol/l 7,5 9,5 11,5 13,5 15,5 17,5 19,5 (adaptado de Diabetes Care, vol. 26 supl.1 Jan 2003, S108) ADENDA Composição dos Reagentes: Reagente 1 Biftalato de potássio 50 mm; detergente 5 g/l; azida de sódio 0,95 g/l; ph 5,0. Reagente 2 Tampão fosfato 30 mm, ph 6,5; azida de sódio 0,95 g/l Reagente 3 Tampão fosfato 72 mm, ph 6,5; azida de sódio 0,95 g/l Colunas contém resina catiónica, equilibrada com tampão fosfato 72 mm, ph 6,5 e azida de sódio 0,95 g/l. NOTAS IMPORTANTES SOBRE A AZIDA DE SÓDIO: - Evite ingerir ou o contacto com a pele ou mucosas. - No caso de contacto com a pele, lave imediatamente com bastante água. - No caso de contacto com os olhos e se ingerido, dirija-se ao Centro de Saúde ou Hospital mais próximo. - A azida de sódio reage facilmente com o chumbo ou cobre dos lavatórios/superfície de metal e forma compostos de azida altamente explosivos. - Os tubos contendo azida de sódio devem ser colocados em contentor próprio para resíduos perigosos. - Em caso de derrame, as superfícies de metal deverão ser lavadas com uma solução de 10% de hidróxido de sódio (NaOH) para descontaminação. 2