Fundamentos e Formalismos Teóricos da Cromatografia
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1 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO SECRETARIA DE EDUCAÇÃO PROFISSIONAL E TECNOLÓGICA INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA CAMPUS FLORIANÓPOLIS SANTA CATARINA Fundamentos e Formalismos Teóricos da Cromatografia Prof. Marcel Piovezan marcel.piovezan@ifsc.edu.br UC: Análise Instrumental II
2 Cromatografia em coluna com detecção por UV-Vis Relatório da prática: Cromatograma e: N = µ = H = k A e k V = Rs = t RA e t RV = α = V RA e V RV = V 0 =
3 Cromatografia em coluna com detecção por UV-Vis Resultado da prática: Construa dois cromatogramas, um que relacione o Volume total eluído (ml) de FM versus Abs (610 nm) e outro Abs (520 nm) no mesmo gráfico para cada uma das condições testadas.
4 Cromatografia em coluna com detecção por UV-Vis Abs Resultado da prática: Construa dois cromatogramas, um que relacione o Volume total eluído (ml) de FM versus Abs (610 nm) e outro Abs (520 nm) no mesmo gráfico para cada uma das condições testadas. 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 A520nm A V? V total FM (ml)
5 A separação foi boa? O que significa ser boa? EFICIÊNCIA DA SEPARAÇÃO Eficiência da coluna em separar dois solutos depende em parte das velocidades relativas segundo os quais são eluídos. E a eluição depende do equilíbrio destes entre as fases móvel e estacionária A FM A FE
6 COEFICIENTE DE PARTIÇÃO, K A FM A FE isoterma de distribuição C FE K = C FE C FM cromatografi a linear A = analito A C FE = Concentração de A na fase estacionária C FM = Concentração de A na fase móvel C FM
7 O resultado de uma cromatografia em geral é um gráfico que correlaciona a medida de um sinal de um detector adequado com relação ao tempo decorrido ou ao volume do eluente. O formato é de pico gaussiana. O tempo ou volume pode ser usado para identificá-lo, a área sob o pico pode ser utilizada para medida quantitativa. Sinal do detector Amostra t R2 t R1 Detector Tempo
8 CROMATOGRAFIA: Teoria Básica Diluição do analito Consiste no alargamento da zona original (banda de aplicação da amostra) à medida que os componentes da mistura são separados; Implica no uso de detectores mais sensíveis.
9 CROMATOGRAFIA: Teoria Básica Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase móvel. K [A] FE A = [A] FM K = constante de distribuição do analito [A] FE = concentração do analito na FE [A] FM = concentração do analito na FM Afinidade pela FE [A] FE MENOR RETENÇÃO Afinidade pela FM [A] FM Sendo K A > K B qual substância ficará mais tempo retida?
10 Quantificação da eficiência: Número de Pratos (N) Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM: O número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por: Cada estágio de equilíbrio é chamado de PRATO TEÓRICO t R ou V R W b N Coluna mais eficiente
11 Abs Quantificação da eficiência: Número de Pratos (N) 2 A520nm 1,5 1 A V Unidades: sempre as mesmas, pois N é adimencional 0, O número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por: V total FM (ml) Faça o seu!!! t R ou V R W b N Coluna mais eficiente
12 CROMATOGRAFIA: Quantificação da eficiência ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H) Tamanho de cada estágio de equilíbrio Valores típicos de H e N: H = L N (L = comprimento da coluna) Capilares, L = 30 m Empacotadas, L = 2 m d c = diâmetro da coluna em mm d f = espessura da fase estacionária em m Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes.
13 CROMATOGRAFIA: Quantificação da eficiência ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H) Tamanho de cada estágio de equilíbrio H = L N (L = comprimento da coluna) Valores típicos de H e N: Unidades: Tipicamente L e H São expressos em mm Faça o seu!!!
14 CROMATOGRAFIA: CÁLCULOS Sinal do detector Amostra t R = t R + t M t R t M t E Detector Tempo
15 CROMATOGRAFIA: CÁLCULOS
16 CROMATOGRAFIA: CÁLCULOS Abs Faça o seu!!! 2 1,5 1 A V t R = t R + t M V R = t R. F 0, t M = 5 ml t RV = 25 ml t RV =? t M = 5 ml t RA = 75 ml t RA =? V total FM (ml)
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19 diâmetro = 22 mm C = mm V 0 =?
20 CROMATOGRAFIA: CÁLCULOS Sinal do detector Coluna L t R t M t E Detector Tempo
21 CROMATOGRAFIA: CÁLCULOS Abs Faça o seu!!! 2 1,5 1 A V u =? L = cm V M = 5 ml F = 1 cm 3 /min 0, V total FM (ml) V R = t R. F
22 CROMATOGRAFIA: Comparar velocidades de migração
23 Abs CROMATOGRAFIA: Comparar velocidades de migração Faça o seu!!! k A =? k V =? 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 A V V total FM (ml)
24 CROMATOGRAFIA: Compara a capacidade de separação entre 2 analitos Sendo B o soluto mais retido que A Sempre 1 (quando = 1, A e B co-eluem) (t R ) B (t R ) A t M A B Tempo
25 CROMATOGRAFIA: Compara a capacidade de separação entre 2 analitos Faça o seu!!! V A Sendo V o soluto mais retido que A Sempre 1 (quando = 1, A e V co-eluem) (t R ) V (t R ) A A V t M A V Tempo
26 Sinal do detector Sinal do detector CROMATOGRAFIA: Medida quantitativa da separação de 2 picos consecutivos Resolução (R S ) (t R ) B (t R ) A (t R ) B - (t R ) A R S = 2 [(t R ) B - (t R ) A ] (W A + W B ) Unidades: t R e W São expressos na mesma unidade W A tempo W B (t R ) B (t R ) B - (t R ) A (t R ) A W A tempo W B
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32 Sinal do detector Abs CROMATOGRAFIA: Medida quantitativa da separação de 2 picos consecutivos Resolução (R S ) (t R ) B (t R ) A (t R ) B - (t R ) A R S = 2 [(t R ) B - (t R ) A ] (W A + W B ) R s =? W A tempo W B Unidades: t R e W São expressos na mesma unidade Faça o seu!!! 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 A V V total FM (ml)
33 Resumão: FATOR DE RETENÇÃO (k): razão entre a massa do soluto presente na FM e na FE. Quanto maior o k, maior o tempo de retenção na coluna. Juntamente com o fluxo, determina o TR do pico. SELETIVIDADE (α): relação entre o tempo que 2 solutos passam na fase líquida. Mede a capacidade de separação entre 2 picos e é alterada com a troca do solvente da FM, ph, FE e temperatura. α
34 Resumão: EFICIÊNCIA DA COLUNA: Número de pratos teóricos (N): número de distribuição de equilíbrio entre a fase móvel e a estacionária. Quanto maior o nº de N, mais eficiente a coluna. RESOLUÇÃO: Medida quantitativa da separação de 2 picos consecutivos, determinada pela distância entre os t R s e a largura da base dos picos.
35 FÓRMULAS R E = 2 [(t R ) B - (t R ) A ] (W A + W B )
36 DEFINIÇÕES GERAIS: α = T R (B) T R (A) A B Rs = t N = 16 T R 2 w b2 w b
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