FCVA/ UNESP JABOTICABAL FUNDAMENTOS DE CROMATOGRAFIA. DOCENTE: Prof a. Dr a. Luciana Maria Saran

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1 FCVA/ UNESP JABOTICABAL CURSO: Engenharia Agronômica FUNDAMENTOS DE CROMATOGRAFIA DOCENTE: Prof a. Dr a. Luciana Maria Saran

2 1. CROMATOGRAFIA 1.1. Histórico A palavra cromatografia é de origem grega (kromatos cor; graphos escrita) e foi usada pela 1 a vez em 1906, pelo botânico russo Michael Tswett, para descrever a separação de pigmentos de plantas em zonas de cores distintas. A partir de 1906 o uso da cromatografia se tornou popular como um método de identificação e de separação de substâncias. Atualmente, o método aplica-se também a substâncias incolores, porém o nome original foi mantido.

3 1. CROMATOGRAFIA 1.1. Histórico Os termos cromatograma, cromatografia e método cromatográfico, aparecem em dois trabalhos de Tswett, que descrevem suas experiências para separar pigmentos de folhas e gemas de ovo, usando uma coluna empacotada com CaCO 3 finamente dividido (fase estacionária) e éter de petróleo (fase móvel). A separação dos componentes pode ser verificada por meio de faixas coloridas na coluna. éter de petróleo CaCO 3

4 1. CROMATOGRAFIA 1.2. Fundamentos do Método É um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura. A separação é realizada através da distribuição dos componentes da mistura entre 2 fases que estão em contato íntimo. Nos processos cromatográficos estão sempre envolvidas 2 fases (fase móvel e fase estacionária), sendo que uma se locomove através de uma outra.

5 1. CROMATOGRAFIA 1.2. Fundamentos do Método A fase que se move denomina-se fase móvel. Gases e líquidos são usados como fases móveis. A fase que não se move denomina-se fase estacionária ou suporte. Como fase estacionária, são empregados sólidos e líquidos.

6 1. CROMATOGRAFIA 1.2. Fundamentos do Método Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais destes componentes.

7 Transporte dos Componentes de uma Amostra por uma Fase Móvel Através de uma Fase Estacionária

8 2. APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA Identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes. Purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis. Separação dos componentes de uma mistura. Em análises qualitativas e quantitativas.

9 3. CRITÉRIOS PARA A CLASSIFICAÇÃO DAS DIFERENTES FORMAS DE CROMATOGRAFIA Forma física do sistema cromatográfico. Fase móvel empregada. Fase estacionária utilizada. Modo de separação.

10 3.1. CLASSIFICAÇÃO PELA FORMA FÍSICA DO SISTEMA CROMATOGRÁFICO A forma física do sistema cromatográfico define a técnica geral, ou seja, a fase estacionária pode ser colocada em um tubo cilíndrico ou disposta sobre uma superfície planar. Cromatografia em coluna Cromatografia planar: - cromatografia em papel (CP); - cromatografia em camada delgada (CCD).

11 3.2. CLASSIFICAÇÃO PELA FASE MÓVEL EMPREGADA Considerando o estado físico da fase móvel, distingui-se: - cromatografia líquida: a fase móvel é um líquido. - cromatografia gasosa: a fase móvel é um gás. - cromatografia supercrítica: a fase móvel é um vapor pressurizado, em temperatura acima da sua temperatura crítica.

12 3.2. CLASSIFICAÇÃO PELA FASE MÓVEL EMPREGADA Cromatografia Líquida: - Cromatografia líquida clássica (CLC), na qual a fase móvel é arrastada através da coluna apenas pela força da gravidade. - Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), na qual são utilizadas fases estacionárias de partículas menores, sendo necessário o uso de uma bomba de alta pressão para a eluição da fase móvel.

13 3.2. CLASSIFICAÇÃO PELA FASE MÓVEL EMPREGADA Cromatografia Gasosa (CG). Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR). Obs.: A diferença entre os dois tipos está na coluna. Na CGAR são usadas colunas capilares, enquanto na CG são empregas colunas de maior diâmetro.

14 3.3. CLASSIFICAÇÃO PELA FASE ESTACIONÁRIA UTILIZADA Fases estacionárias sólidas Fases estacionárias líquidas Fases estacionárias quimicamente ligadas

15 3.4. CLASSIFICAÇÃO PELO MODO DE SEPARAÇÃO De acordo com este critério, as separações cromatográficas são devidas aos seguintes mecanismos: - adsorção - partição - troca iônica

16 DIFERENÇA ENTRE ABSORÇÃO E ADSORÇÃO ABSORVER: ato de passar uma substância para o interior da outra. ADSORVER: ligar uma substância a uma superfície. A superfície adsorve a substância. Distingue-se de absorver.

17 FENÔMENOS DE ADSORÇÃO E ABSORÇÃO NAS ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS Cromatografia de Adsorção Moléculas menores penetram na fase estacionária (gel) Cromatografia de Exclusão Molecular ou Cromatografia de Penetração em Gel

18 4. CROMATOGRAFIA EM COLUNA 4.1. Cromatografia Líquida Clássica Fases estacionárias mais usadas: sílica e alumina. A fase estacionária é acondicionada em tubos cilíndricos de vidro, de diâmetros variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior. FONTE: DEGANI, A. L.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia um Breve Ensaio. Química Nova na Escola, n. 7, p. 23, 1998.

19 4. CROMATOGRAFIA EM COLUNA 4.1. Cromatografia Líquida Clássica O fluido que entra na coluna é chamado de eluente e o fluido que emerge ao final da coluna é chamado de eluato. eluente entrada COLUNA eluato saída O processo de passagem de um líquido ou de um gás por uma coluna cromatográfica é denominado eluição.

20 Representação Esquemática de uma Separação Cromatográfica (a) Solução contendo os solutos A e B, colocados no topo de uma coluna empacotada com partículas sólidas e preenchida com solvente. (b) Adição de mais solvente no topo da coluna e escoamento da mistura pela coluna devido ao fluxo contínuo de solvente. (c) O soluto A, com uma afinidade maior pela fase estacionária do que o soluto B, permanece mais tempo ao longo da coluna.

21 Representação Esquemática de uma Separação Cromatográfica

22 4.2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Baseada no uso de suporte com partículas diminutas responsáveis pela alta eficiência, as quais tornam necessário o uso de bombas de alta pressão para a eluição da fase móvel, devido sua baixa permeabilidade. As colunas são geralmente de aço inoxidável. Graças ao grande número de fases estacionárias existentes, é possível realizar análises e separações de uma ampla gamas de compostos com alta eficiência.

23 EQUIPAMENTO BÁSICO DE CLAE a) Reservatório da fase móvel; b) Bomba de alta pressão; c) Válvula de injeção; d) Coluna; e) Detector; f) Registrador. FONTE: DEGANI, A. L.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia um Breve Ensaio. Química Nova na Escola, n. 7, p. 24, 1998.

24 EQUIPAMENTO BÁSICO DE CLAE

25 EQUIPAMENTO PARA DE CLAE

26 COLUNA PARA CLAE

27 COMPARTIMENTO ONDE É INSERIDA A COLUNA 27

28 RESERVATÓRIO DA FASE MÓVEL 28

29 SISTEMA DE INJEÇÃO AUTOMÁTICA DE AMOSTRA 29

30 Frasco para Amostra 30

31 SISTEMA PARA RECEBIMENTO E ARMAZENAMENTO DOS COMPOSTOS SEPARADOS POR CLAE 31

32 DETECTORES 32

33 4.2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Cromatograma: gráfico que mostra a resposta do detector em função do tempo de eluição. O cromatograma é útil para análises qualitativas e quantitativas. A posição dos picos no eixo do tempo podem ser empregadas para identificar os componentes da amostra, enquanto as áreas dos picos provêm uma medida quantitativa da quantidade de cada uma das espécies. O tempo de retenção, t r, para cada componente é o tempo necessário, a partir da injeção da mistura na coluna, para que o componente alcance o detector.

34 CROMATOGRAMA MOSTRANDO A SEPARÇÃO DOS ENANTIÔMEROS DO TETRAMISOL FONTE: DEGANI, A. L.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia um Breve Ensaio. Química Nova na Escola, n. 7, p. 24, 1998.

35 5. CROMATOGRAFIA GASOSA Mecanismo de separação: baseado na partição dos componentes de uma amostra entre a fase móvel gasosa e a fase estacionária (líquido não volátil ou sólido). É muito atrativa devido a possibilidade de detecção em escala de nano a picogramas ( g). Principal limitação da técnica: necessidade de que a amostra seja volátil ou termicamente estável. Os gases usados como fase móvel devem ter elevada pureza e ser inertes em relação a fase estacionária. Os gases mais usados são: H 2, N 2 e He (gases de arraste).

36 5. CROMATOGRAFIA GASOSA Nesta modalidade de cromatografia uma amostra líquida volátil ou gasosa, é injetada através de um septo (um disco de borracha) para dentro de uma entrada de injeção aquecida, onde é rapidamente vaporizada. O vapor é arrastado através da coluna por meio de um gás de arraste (He, N 2 ou H 2 ) e os analitos separados fluem pelo detector, cuja resposta é observada em um computador.

37 DIAGRAMA ESQUEMÁTICO DE UM CROMATÓGRAFO A GÁS

38

39 CROMATÓGRAFO A GÁS Forno da Coluna 39

40 CROMATÓGRAFO A GÁS Coluna 40

41 FORNO DE UM CROMATÓGRAFO A GÁS Coluna 41

42 ENTRADAS PARA INJEÇÃO DA AMOSTRA 42

43 SERINGAS PARA INJEÇÃO DE AMOSTRAS LÍQUIDAS 43

44 SERINGA PARA INJEÇÃO DE AMOSTRA GASOSA 44

45 CROMATOGRAMA NA TELA DO MONITOR DO COMPUTADOR ACOPLADO AO CROMATÓGRAFO 45

46 5. CROMATOGRAFIA GASOSA Classificação: - Cromatografia Gás-Líquido (CGL). Fase móvel: gasosa. Fase estacionária: líquido não-volátil que recobre a coluna internamente ou um suporte sólido finamente dividido. Mecanismo de separação: partição 46

47 5. CROMATOGRAFIA GASOSA Classificação: - Cromatografia Gás-Sólido (CGS). Fase móvel: gasosa. Fase estacionária: sólida. Mecanismo de separação: adsorção 47

48 5. CROMATOGRAFIA GASOSA São empregadas colunas capilares estreitas e compridas, feitas de sílica fundida(sio 2 ) recobertas com poliimida (um plástico capaz de resistir até 350ºC) para suportar e proteger a coluna da umidade atmosférica. Colunas:. Diâmetro interno: 0,10 a 0,53 nm. Comprimento: 15 a 100 m, sendo comum com 30 m (a) Dimensões normais de uma coluna capilar por cromatografia a gás. (b) Coluna de sílica fundida. O diâmetro da armação que suporta a coluna, é de 0,2 m (ou 20 cm) e os comprimentos usuais da coluna são de 15 a 100 m. 48

49 COLUNA CAPILAR PARA CROMATOGRAFIA GASOSA 49

50 COLUNAS CROMATOGRÁFICAS USADAS EM CG (a) Coluna capilar de parede recoberta: caracteriza-se por um filme, com a espessura de 0,1 e 0,5 µm, da fase estacionária líquida sobre a parede interna da coluna. (a) (b) (c) (b) Coluna capilar recoberta com um suporte: tem partículas sólidas, presas na parede interna da coluna, recobertas com a fase estacionária líquida. (c) Coluna capilar com camada porosa: contém uma fase estacionária sólida sobre a parede interna da coluna. Neste caso, as partículas sólidas são a fase estacionária ativa.

51 OUTROS TIPOS DE COLUNA PARA CG 51

52 REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UM CROMATOGRAMA GASOSO, MOSTRANDO COMO SÃO MEDIDOS OS TEMPOS DE RETENÇÃO

53

54 6. ANÁLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA A análise quantitativa em cromatografia é baseada em estabelecer o valor da área da banda cromatográfica. Na CG e na CLAE a banda é registrada como um pico que, idealmente deve ter formato gaussiano. A área do pico é proporcional a quantidade da substância na amostra analisada. Equipamentos com integradores eletrônicos, dispensam a medida manual da área dos picos.

55 6. ANÁLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA Cálculo da área do pico: a área do pico pode ser calculada traçando-se tangentes dos dois lados do pico. A intersecção destas duas tangentes com a linha de base fornece um triângulo cuja área pode ser calculada pela seguinte fórmula: A = (a. w b )/2 Na equação acima: A = área do pico a = altura do pico w b = largura do pico na linha de base

56 6. ANÁLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA Construção da Curva Analítica ou Curva de Calibração: 1. Preparam-se várias soluções da substância a ser quantificada, em diferentes concentrações. 2. Obtém-se o cromatograma correspondente a cada uma delas. 3. Em um gráfico relacionam-se as áreas obtidas com as concentrações e a partir do gráfico, pode-se calcular a concentração desta substância na amostra.

57 CURVA ANALÍTICA OU CURVA DE CALIBRAÇÃO

58 Área (mm 2 ) CURVA ANALÍTICA OU CURVA DE CALIBRAÇÃO C (g L -1 ) Área (mm 2 ) 2, , , , , Y = 91,31 + 8,49X C (g L -1 )

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