Práticas Laboratoriais de Diagnóstico e Teoria do Restauro II (Ciências da Arte e do Património)
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- Therezinha Bergmann de Mendonça
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1 Práticas Laboratoriais de Diagnóstico e Teoria do Restauro II (Ciências da Arte e do Património) Cromatografia de adsorção 1. Objectivo Separação de uma mistura de corantes (alaranjado de metilo e azul de metileno) por cromatografia de adsorção em coluna e em camada fina. 2. Introdução Existem numerosos métodos de separação de substâncias, todos eles baseados nas diferenças que essas substâncias apresentam nas suas propriedades físico-químicas (estado físico, solubilidade, etc). Um dos métodos universais de separação de compostos é a cromatografia. As técnicas cromatográficas destinam-se a separar componentes de misturas e baseiam-se todas na diferente distribuição (diferencial) dos vários componentes de uma mistura entre duas fases a fase móvel e a fase estacionária. A separação ocorre devido aos diferentes graus de partição dos diversos componentes entre as duas fases. A fase móvel pode ser um líquido ou um gás e a fase estacionária pode ser sólida ou líquida. As diversas combinações entre estas duas fases originam os diferentes tipos de técnicas cromatográficas, conforme o critério de classificação considerado. Assim, entre outros, pode-se falar de cromatografia líquida ou gasosa, se se considera o estado físico do eluente, de cromatografia de adsorção ou de partição, se se considera o fenómeno que dá lugar às interacções entre o soluto e as fases cromatográficas, ou ainda de cromatografia em coluna ou em camada fina, se se toma o suporte cromatográfico como critério de classificação. No presente trabalho vai-se ilustrar o uso da cromatografia na separação da mistura de corantes recorrendo a dois tipos de cromatografia de adsorção: a cromatografia em coluna e a 1
2 cromatografia em camada fina. Em ambos os casos a fase estacionária é um sólido poroso capaz de adsorver solventes e solutos. Os materiais mais utilizados são a sílica gel (SiO 2 ) e a alumina (Al 2 O 3 ). A fase móvel é o etanol. Na cromatografia em coluna, a fase móvel (eluente) é obrigada a percorrer uma coluna cheia com a fase estacionária. Coloca-se no topo da coluna uma solução concentrada, contendo os componentes a separar, de modo a formar uma banda pouco espessa. Adiciona-se então o eluente que arrasta os componentes através da coluna, com velocidades diferentes consoante a afinidade relativa dos componentes da mistura para o adsorvente (fase estacionária) e a sua solubilidade em etanol. Na cromatografia em camada fina a fase estacionária é suportada, como um filme, numa superfície plana (placa de vidro ou metal). Uma pequena gota da mistura a separar é aplicada próximo de uma extremidade da placa fina recoberta com a fase estacionária sólida adsorvente (por exemplo, sílica gel). A extremidade da placa é então mergulhada numa câmara de eluição, contendo uma pequena quantidade do eluente adequado (fase móvel), o qual sobe na placa por capilaridade. À medida que o eluente sobe a placa (eluição) arrasta consigo os componentes da mistura a diferentes velocidades, dependendo da tendência de cada componente para ficar agarrado à placa ou dissolver no eluente. A velocidade de fluxo de determinado componente pode ser traduzida através do parâmetro Rf (rate of flow ou velocidade de fluxo) que se define como: R F Distância percorrida pela manchadesde alinha de aplicação Distância percorrida pelo frentedo eluente Rf é característico de determinada substância sob determinadas condições. No entanto, depende fortemente de parâmetros experimentais como temperatura, humidade atmosférica, condições de eluição, entre outros, pelo que não é um parâmetro tabelável. Assim, e apesar de ser útil na identificação de substâncias por comparação com os valores de Rf de compostos padrão conhecidos, tal comparação só tem significado se for garantida a medição de Rf em condições rigorosamente iguais. Na prática tal assegura-se mediante análise simultânea de padrões e da mistura a analisar, colocados na mesma placa que será submetida a um único processo de eluição. 2
3 3. Material e Equipamento 1 tina cromatográfica, capilares, coluna com placa porosa, pipetas de Pasteur, 1 pipeta graduada de 2 ml, tubos de ensaio e respectivo suporte, 3 copos de 100 ml, funil, placas cromatográficas de sílica para cromatografia em camada fina (CCF). Alumina, etanol, soluções de azul de metileno e alaranjado de metilo e respectiva mistura, amónia concentrada, água destilada. 4. Procedimento Parte A. Cromatografia em camada fina 1. Numa placa cromatográfica de 3x7 cm, trace a lápis uma linha paralela a um dos topos e a uma distância deste de cerca de 1 cm, tendo o cuidado de não danificar a sílica. Ainda com a ajuda da régua marque 3 pontos equidistantes sobre a linha desenhada. 2. Com a ajuda de um capilar coloque cuidadosamente uma pequena gota da solução mistura e, de cada um dos lados, uma gota de cada uma das soluções de alaranjado de metilo e de azul de metileno nos pontos assinalados (as gotas deverão ficar bem separadas). 3. Seque as gotas com um secador. 4. Introduza a placa na câmara cromatográfica contendo a solução eluente (copo com um pouco de etanol), tendo o cuidado de verificar que os pontos de aplicação das amostras não fiquem, no início, mergulhados no eluente (o nível do eluente deve ser inferior ao da linha marcada a lápis!). Tape a câmara e não lhe mexa até se ter completado a eluição. 5. Vá observando a placa e deixe o eluente subir a placa por capilaridade até atingir cerca de 1 cm da extremidade superior da placa. Tenha cuidado para não deixar chegar ao topo da placa. 6. Quando a eluição estiver completa, tire a placa do copo com uma pinça. Marque imediatamente com um lápis até onde chegou o eluente. Parte B. Cromatografia em coluna 1. Num copo de 100 ml prepare uma papa etanólica, utilizando alumina e etanol e verta-a para uma coluna de vidro com placa porosa, em posição vertical, com a ajuda de um funil. Deposite a mistura gradualmente na coluna deixando simultaneamente o etanol fluir muito lentamente através dela. Se for necessário, adicione mais etanol no topo da coluna. Nunca deixe secar. O 3
4 enchimento da coluna deve ser o mais homogéneo possível, sem apresentar bolhas de ar. A altura final deve ser de aproximadamente 4-5 cm. 2. Verta cuidadosamente a solução mistura (1 ml), tendo o cuidado de não perturbar a superfície da fase estacionária. 3. Passe etanol através da coluna, tendo o cuidado de não a deixar secar (revelação do cromatograma). Distingue-se de imediato a descida de um anel azul ao longo da coluna, mantendo-se na parte superior da mesma um anel amarelo. Eluirá desta forma o azul de metileno. Recolha o eluente contendo este corante numa série de tubos e em volumes aproximadamente iguais ( 1mL), até a solução sair incolor. 4. Elua em seguida o alaranjado de metilo com água destilada contendo umas gotas de amónia concentrada (1 a 2 gotas por 100 ml de água), como descrito em Tratamento dos Resultados 1. Parte A. Cromatografia em camada fina 1. Determine os valores do factor de retenção R F tendo em conta a expressão anterior. Para medir a distância percorrida pela mancha, mede-se a distância entre a linha de partida e a frente da mancha, uma vez que muitas vezes é impossível localizar o centro da mancha ou o ponto de maior concentração. Registe os valores numa tabela do tipo: Distância percorrida / cm R F Eluente Azul de metileno Alaranjado de metilo Mistura 2. Face ao cromatograma obtido e aos valores de Rf que determinou, conclua sobre a composição da mistura a analisar e comente a eficiência da separação. 3. Porque é que é importante usar um lápis para marcar a linha de base na placa cromatográfica e não deve usar uma caneta? 4. Justifique o cuidado em manter o nível de eluente abaixo da linha em que se aplicaram as gotas das amostras na placa de cromatografia em camada fina. 4
5 5. Porque é que não se deixa o eluente subir até ao topo da placa, isto é, até não haver mais placa? Parte B. Cromatografia em coluna 1. Analise visualmente a sucessão da eluição e construa uma tabela do tipo a seguir indicado para cada uma das eluições: Número da amostra Cor Produto Uma vez que todos os tubos de ensaio têm volumes eluídos aproximadamente iguais, esboce um cromatograma para a cromatografia em coluna. Partes A e B. Cromatografia de adsorção em camada fina e em coluna Compare o processo cromatográfico utilizado na separação do azul de metileno e do alaranjado de metilo para ambas as técnicas utilizadas. 6. Bibliografia [1] David C. Eaton, Laboratory Investigations in Organic Chemistry, McGraw-Hill, Inc., New York, [2] Organikum - Química Orgânica Experimental, tradução de A. P. Rauter, B. J. Herold, 2ª Edição, Fundação Calouste Gulbenkian, Lisboa [3] A. Vogel, Textbook of Practical Organic Chemistry, London, [4] J. A. Martinho Simões, M. A. R. Botas Castanho, I. M. S. Lampreia, F. J. V. Santos, C. A. Nieto de Castro, M. F. Norberto, M. T. Pamplona, L. Mira, M. M. Meireles, Guia do Laboratório de Química e Bioquímica; Lidel: Lisboa,
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