Análise Cromatográfica Planar

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1 Nome do primeiro autor, 1 Nome do segundo autor, 1 Nome do terceiro autor, 2 Análise Cromatográfica Planar 1 Nome da instituição, endereço para correspondência, 2 Nome da instituição, endereço para correspondência, CONEM Resumo: O presente artigo reporta ao estudo de separação e identificação dos pigmentos existentes nas folhas de espinafre. A identificação dos pigmentos dar-se-á, primeiramente, por intermédio de visualização direta das diferentes zonas cromatográficas exibidas e, posteriormente, comparando-as com um paradigma. Corroborando para o presente feito, dispôs-se de técnica analítica denominada cromatografia planar em suporte papel. Após as etapas de separação e identificação dos pigmentos, proceder-se-á à realização de cálculos cromatográficos, tais como: fator de retenção, resolução e número de pratos teóricos, com o intuito de se analisar e comparar a eficiência dos cromatógrafos experimentais. Palavras-chave: cromatografia, polaridade, fase móvel, fase estacionária, solubilidade 1. INTRODUÇÃO A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. (Degani et al., 2008) Assim, a separação de uma mistura em um sistema cromatográfico depende das interações que ocorrem entre os componentes da mistura e as fases estacionária e móvel. (Fonseca e Gonçalves, 2004) As duas fases são escolhidas de modo que os componentes da amostra distribuam-se entre as fases móvel e estacionária em graus variados. Os componentes que são retidos mais fortemente na fase estacionária movem-se mais lentamente no fluxo da fase móvel. Ao contrário, os componentes que interagem mais fracamente com a fase estacionária movem-se mais rapidadamente. (Skoog, 2006) Conforme mencionado anteriormente, a cromatografia está baseada na repartição dos analitos entre as duas fases, uma estacionária, e a outra móvel. A separação entre dois, ou mais componentes resultará da diferença de suas constantes de equilíbrio de distribuição entre as duas fases, simplificando, quando mais tenazmente um componente é preso pela fase estacionaria, mais alta é a porcentagem das moléculas daquele componente que ficam retidos provocando um retardamento na migração das mesmas. Um segundo componente menos retido na fase estacionária terá uma porcentagem mais alta na fase móvel em relação ao primeiro componente. Assim, o conjunto de moléculas deste componente se moverá em direção ao fluxo mais rapidamente. (Aquino Neto e Nunes, 2003) A cromatografia é uma técnica de separação especialmente adequada para ilustrar os conceitos de interações intermoleculares, polaridade e propriedades de funções orgânicas. (Nunes e Ribeiro, 2008) A polaridade consiste numa propriedade química no tocante à diferença de eletronegatividade entre átomos de substâncias. Assim, eletronegatividade consiste na tendência de um átomo em atrair elétrons compartilhados numa ligação química. Numa ligação covalente polar, o par de elétrons compartilhados não é igualmente distribuído entre os átomos participantes; o átomo com maior eletronegatividade puxa para si o par de elétrons. Quanto maior a diferença de eletronegatividade entre os átomos maior será a polarização, tendo, desde uma ligação covalente polar, até uma ligação iônica. Numa substância apolar, os átomos apresentam polaridades muito próximas e/ou iguais. A técnica de cromatografia tem a finalidade de identificar compostos, comparando-os com padrões existentes; purificá-los, com o intuito de remover substâncias indesejáveis e serve também para a separação de componentes de uma mistura. (Degani et a.l, 2008) Os métodos cromatográficos podem ser classificados de dois modos. A primeira classificação baseia-se no meio físico no qual as fases estacionária e móvel entram em contato: cromatografia em coluna e cromatografia planar. Uma

2 classificação mais fundamental dos métodos cromatográficos baseia-se nos tipos de fases móveis e estacionárias e nos tipos de equilíbrios envolvidos na transferência dos solutos entre as fases. (Skoog, 2006) Figura 1. Esquema contendo classificação de técnicas cromatográficas. (CCD cromatografia em camada delgada; CSC cromatografia com fluído supercrítico; CG cromatografia gasosa e CGAR cromatografia gasosa de alta resolução) Fonte: Degani, et al., No laboratório em comento tem-se cromatografia planar em papel; fase móvel líquida utilizada álcool 95% e éter de petróleo; fase estacionária líquida água; fase normal; sendo o método de separação classificado como partição. A cromatografia em papel é uma técnica simples para análise de amostras em pequenas quantidades aplicadas principalmente na separação e identificação de componentes polares. O papel consiste de celulose praticamente pura, que pode absorver até 22% de água. É a água absorvida que funciona como fase estacionária líquida que interage com a fase móvel também líquida. Neste caso, a fase estacionária é suportada nos poros do papel e a fase móvel se movimenta através da fase estacionária por ação de capilaridade. (Aquino Neto e Nunes, 2.003) No tocante à fase normal, está é caracterizada por uma maior polaridade da fase estacionária. Quanto ao método de partição, tem-se que neste método a fase estacionária e a fase móvel são líquidos, sendo que uma dessas fases está fixada a um suporte sólido. Ela se baseia na diferença de solubilidade das substâncias em questão entre as duas fases imiscíveis. O solvente é saturado em água e a partição se dá devido à presença de água em celulose (papel de filtro). (Degani, et al., 2.008) 2. PARTE EXPERIMENTAL 2.1 Materiais utilizados Papel de filtro; tubo de ensaio; etanol 95%; éter de petróleo; extrato de folha cozida de espinafre; extrato de folha de espinafre; conta gotas Analitos e fase móvel utilizados Foram realizados três experimentos cromatográficos. O diferencial consiste nos analitos utilizados e nas respectivas fases móvel. Para o primeiro experimento, dispôs-se de extrato de folha cozida de espinafre (analito) e álcool 95% (fase móvel). No segundo experimento, usou-se como analito, extrato de folha de espinafre; para a fase móvel, álcool 95%. Por último, teve-se como analito, novamente, extrato de folha de espinafre e, a fase móvel, éter de petróleo Procedimentos Experimentais Para cada um dos três experimentos realizados, seguiram-se os seguintes passos: Preencheu-se o tubo de ensaio com cerca de 1 cm de fase móvel. Recortou-se tira de papel de filtro com largura de 1,5 cm. Aplicou-se uma gota da amostra (analito) próximo à base do papel (cromatografia ascendente), cerca de 1,5 cm acima da borda dispondo-se para tal, de um conta gotas.

3 Mergulhou-se, cuidadosamente, a tira de papel no tubo de ensaio contendo a fase móvel, afim de que o analito não entrasse em contato diretamente com a mesma. Aguardou-se a eluição por 15 minutos. Após isso, retirou-se a tira de papel do tubo de ensaio e procedeu-se as anotações pertinentes à parte de discussão do experimento. 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES Os pigmentos mais importantes existentes nas plantas são as clorofilas A e B, que lhes conferem a cor verde. Os outros pigmentos existentes são os carotenóides. As colorações dos carotenóides variam do amarelo, passando pelo laranja, até o vermelho intenso e resulta da multiplicidade de duplas ligações conjugadas. Os carotenóides podem ser classificados em duas grandes famílias: os carotenos (carotenóides hidrocarbonetos) e as xantofilas (carotenóides oxigenados). (Nunes e Ribeiro, 2008) A Figura (2) infra ilustra os pigmentos existentes nas folhas dos espinafres e serviu de modelo para identificação dos componentes da amostra. Figura 2. Ilustração dos pigmentos existentes nas folhas de espinafre. Fonte: Pré-Relatório. Os cromatógrafos do primeiro e segundo experimento revelaram os pigmentos referentes às clorofilas A e B. A diferença experimental reside no tratamento dado ao analito: no primeiro experimento, usou-se extrato de folhas de espinafre cozida, enquanto que no segundo, usou-se extrato de folhas de espinafre, apenas. Já o terceiro experimento demonstrou os pigmentos carotenóide e xantofila para o analito extrato de folhas de espinafre. A Fig. (3) se refere aos cromatógrafos do experimento em análise. Figura 3. Cromatógrafos dos experimentos. Para cada cromatógrafo, procedeu-se aos cálculos do fator de retardamento ou fator de retenção, a fim de se verificar qual componente do analito tem mais afinidade com as fases estacionária e móvel. Por intermédio desses cálculos é possível constatar a qualidade das substâncias presentes na amostra. O fator de retardamento depende da viscosidade, tensão superficial e natureza química da fase. A Equação (1) fornece a expressão utilizada para cálculo do fator de retardamento: Onde: Rf = fator de retardamento ou fator de retenção; (1)

4 Ds = distância percorrida pelo componente observado, a partir da linha de partida e fim no centro da mancha em análise; Dm = distância percorrida pela fase móvel, sendo mensurada a partir do início do analito e com final na linha de chegada. Abaixo, segue Figura (4) ilustrando o procedimento para a mensuração do fator de retardamento. Figura 4. Esquematização de um cromatograma. Fonte: Degani et al., Os dados obtidos para efeito de cálculo do fator de retardamento, bem como os respectivos valores encontrados, foram inseridos na Tab. (1), abaixo: Tabela 1. Dados obtidos dos cromatogramas experimentais e valores dos fatores de retardamento. Número do experimento Pigmento observado Distância percorrida pelo analito - ds (cm) Distância percorrida pela fase móvel - dm (cm) Fator de retardamento Rf 1 Clorofila B 1,70 9,00 0,19 1 Clorofila A 4,20 9,00 0,47 2 Clorofila B 0,80 9,50 0,08 2 Clorofila A 1,80 9,50 0,19 3 Xantofila 0,90 7,50 0,12 3 Caroteno 4,90 7,50 0,65 Analisando os valores encontrados para o fator de retardamento, verifica-se que a razão para os diferentes valores obtidos encontram escopo na diferença de polaridade dos componentes amostrais envolvidos com as fases estacionária e móvel. Torna-se oportuno informar que também há influência da solubilidade. De um modo geral, no tocante à solubilidade, estruturas semelhantes dissolvem estruturas semelhantes, isto é, polar dissolve polar e apolar dissolve apolar. Ainda em análise dos valores encontrados para o fator de retardamento, constata-se que no primeiro experimento, o pigmento de clorofila B é mais hidrossolúvel, apresentando um baixo valor para o fator de retardamento. Isto significa que ele é mais compatível com a fase estacionária, água. Já o pigmento de clorofila A, no primeiro experimento, apresentou um valor ideal de fator de retardamento: 0,47. Fatores de retardamento entre 0,4 e 0,6 são considerados ideais, na cromatografia em papel. (Degani et al., 2.008) Assim, conclui-se que esse componente tem maior afinidade com a fase móvel, sendo arrastado por ela. No segundo experimento, novamente a clorofila B apresentou forte interação com a fase estacionária, porém, mais moderada em relação ao primeiro experimento. A clorofila A também apresentou maior interação com a fase estacionária, entretanto, deslocou-se mais em relação à clorofila B. A Figura (5) apresenta a estrutura química das clorofilas A e B. Comparando-se essas estruturas, constata-se que elas diferem pelo grupo funcional R: enquanto a clorofila A, apresenta o grupo funcional alquila metila, a clorofila B apresenta o grupo funcional carbonila.

5 Figura 5. Estrutura química das clorofilas A e B. O grupo funcional carbonila é altamente polarizado, devido à existência de oxigênio, explicando então, a fraca migração desses componentes, uma vez que a molécula da água é polar e assim, mantém a solubilidade do analito em água. Para a clorofila A, a presença do grupo metila, apolar, caracteriza o arraste desse componente pela fase móvel etanol. Continuando a discussão a respeito do fator de retardamento para os pigmentos das clorofilas A e B, o etanol, um composto orgânico, apresenta em sua estrutura química o grupo funcional hidroxila (oxigênio ligado ao hidrogênio), altamente polar, e também apresenta uma parte apolar ligações entre C e H. Dessa forma, ele é miscível tanto em água, quanto em compostos orgânicos. Já a molécula da água é uma substância fortemente polar. Isso se deve ao oxigênio presente em sua estrutura. A Fig. (6) demonstra a estrutura do etanol e da água. Figura 6. Estrutura química do etanol e da água. Em relação ao terceiro experimento, o fator de retardamento encontrado para o caroteno permite concluir que esse pigmento é altamente atraído pelo eluente, distanciando-se mais do ponto de aplicação da amostra. A Fig. (7) demonstra a estrutura molecular do caroteno. Figura 7. Estrutura molecular do caroteno. Analisando a Figura (7), verifica-se que os carotenos são hidrocarbonetos constituídos de longa cadeia carbônica. Os hidrocarbonetos possuem apenas ligações C-C e C-H. Estruturas desse tipo são apolares, devido apresentarem pouca ou nenhuma diferença de eletronegatividade. Nesses tipos de estrutura química é prevalecido interações do tipo forças de London (forças de atração entre dipolos temporários). A longa cadeia carbônica do caroteno constitui-se em um grupo hidrofóbico, sendo, portanto, pouco polarizado e pouco solúvel em água. Ocorre, então, seu arraste pelo éter de petróleo. O éter de petróleo é caracterizado por ser uma mistura de diversos hidrocarbonetos. Ele é um composto orgânico pertencente ao grupo funcional dos éteres. Os éteres são compostos orgânicos relativamente polar. A estrutura básica de um éter é representada na Fig. (8). Verificando tal figura, constata-se a presença do elemento oxigênio, contribuindo, dessa maneira, para a relativa polaridade da substância. O radical R pode ser um grupo diferente de R.

6 Figura 8. Estrutura básica de um éter. Quanto à xantofila, presente no terceiro experimento, verifica-se que ela apresenta uma interação moderada com a fase estacionária. Isso se deve a sua estrutura molecular: ela apresenta uma longa cadeia carbônica (grupo hidrofóbico), e apresenta também grupos hidroxilas. Estas podem realizar ligações de hidrogênio com a água (fase móvel). Abaixo, segue Fig. (9) representando a estrutura molecular da xantofila. Figura 9. Estrutura molecular da xantofila. Após as análises referentes aos fatores de retardamento e polaridades dos pigmentos observados, bem como das fases estacionária e móvel, definiu-se uma classificação no tocante à polaridade desses componentes experimentais, em ordem crescente, na qual se encontra inserida na Tab. (2): Tabela 2. Polaridade dos pigmentos experimentais, classificados em ordem crescente. éter de petróleo < caroteno < xantofila < clorofila A < clorofila B < etanol < água Seguindo, passa-se a discutir a capacidade de resolução das colunas cromatográficas experimentais. A resolução de uma coluna consiste na mensuração da capacidade de separação de dois componentes consecutivos. Uma coluna com resolução maior que 1 indicam que os componentes observados estão em zonas cromatográficas distintas. Caso o valor encontrado for menor que 1, os componentes observados estão juntos em uma mesma zona cromatográfica. Para o cálculo da resolução, usou-se a Eq. (2), exposta a seguir: Rs = (2) Onde: Rs = resolução da coluna cromatográfica; Ds 1 = distância percorrida pelo componente 1 observado, a partir da linha de partida e fim no centro da mancha em análise; Ds 2 = distância percorrida pelo componente 2 observado, a partir da linha de partida e fim no centro da mancha em análise; Ws 1 = largura longitudinal da mancha 1; Ws 2 = largura longitudinal da mancha 2. Os valores encontrados para a resolução entre os pigmentos observados estão expostos na Tab. (3). Tabela 3. Resolução cromatográfica dos experimentos realizados. Número do experimento Distância percorrida pelo analito 1 Ds 1 Distância percorrida pelo analito 2 Ds 2 (cm) Ws1 (cm) Ws2 (cm) Rs

7 (cm) 1 1,70 4,20 2,80 2,10-1,02 2 0,80 1,80 1,40 0,60-1,00 3 0,90 4,90 1,40 0,20-5,00 Em relação à Tab. (3), visualizamos que os valores mensurados para a resolução dos cromatógrafos experimentais demonstram que a separação dos pigmentos observados foi eficiente, uma vez que todos os resultados obtidos são maiores ou igual a 1, em valor absoluto. Também vale destacar que os pigmentos puderam ser observados de forma nítida. Por fim, calculou-se o número de pratos teóricos das colunas cromatográficas. Esta medida está relacionada à eficiência da coluna em separar os componentes da amostra. Quanto maior o número de pratos teóricos, mais eficiente é a coluna. A Equação (3) indica a expressão necessária para o cálculo descrito neste parágrafo. Np = (3) Onde: Np = número de pratos teóricos da coluna cromatográfica; Ds = distância percorrida pelo componente observado, a partir da linha de partida e fim no centro da mancha em análise; Ws = largura longitudinal da mancha. Os resultados encontrados nos cálculos de número de pratos teóricos encontram-se inseridos na Tab. (4). Considerando os números de pratos teóricos calculados, verifica-se que a coluna é bastante eficiente para a separação do caroteno, já que o valor do número de pratos teóricos encontrado é demasiado alto. Para a separação da clorofila B e da xantofila, a coluna mostrou-se pouco eficiente, uma vez que o número de pratos oscila entre 5 e 7. Por último, em relação à clorofila A, o número de pratos encontrados no segundo cromatógrafo é mais do que o dobro quando comparado com o primeiro cromatógrafo. Ainda assim, o valor medido demonstra que nos dois experimentos a coluna apresentou um número de pratos satisfatório. Tabela 4. Número de pratos teóricos das colunas experimentais. Lar Núm Distância Núm Pigmento gura da ero do percorrida pelo ero de pratos observado mantha - Ws experimento analito - ds (cm) teóricos Np (cm) 1 Clorofila B 1,70 2,80 5,90 1 Clorofila A 4,20 2,10 64,0 0 2 Clorofila B 0,80 1,40 5,22 2 Clorofila A 1,80 0,60 144, 00 3 Xantofila 0,90 1,40 6,61 3 Caroteno 4,90 0, ,00 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS A técnica de cromatografia em papel se mostrou bastante elucidativa no tocante às propriedades físicoquímicas de compostos quando em contato com outras substâncias imiscíveis. Ela permitiu que fossem analisados aspectos inerentes à polaridade, solubilidade e a funções orgânicas. Dessa maneira, a prática dessa técnica desenvolveu os conhecimentos teóricos adquiridos em sala de aula, ocasionando uma maior fixação do conteúdo por parte dos discentes envolvidos. A praticidade dessa técnica, por ser de fácil manuseio e célere em seu desenvolvimento, permitiu que ela fosse aplicada com comodidade para explorar aspectos de cromatografia. Assim, foi possível mensurar valores referentes à

8 resolução e à eficiência de uma coluna cromatográfica, bem como analisar a capacidade dos analitos de se movimentarem frente à fases móveis distintas. Os valores mensurados no parágrafo anterior levaram-nos a concluir que os experimentos comentados, apesar da variação dada ao tratamento do analito, guardaram certa similaridade, sendo que tais valores se mostraram mais distintos quando houve mudança de fase móvel utilizada. 5. REFERÊNCIAS AQUINO NETO, F.R. e NUNES, D.S.S., Cromatografia: princípios básicos e técnicas afins. Rio de Janeiro, RJ: Interciência, DEGANI, et al., Cromatografia: um breve ensaio. Química Nova na Escola, volume 7, p , maio, GONÇALVES, C.C.S. e FONSECA, S.F., Extração de pigmentos do espinafre e separação em coluna de açúcar comercial. Química Nova na Escola, volume 20, p , novembro, NUNES, C.R. e RIBEIRO, N.M., Análise de pigmentos de pimentões por cromatografia em papel. Química Nova na Escola, volume 29, p , agosto, SKOOG, Douglas A., Fundamentos de química analítica. São Paulo, SP: Pioneira Thomson Learning, DIREITOS AUTORAIS