QUI 070 Química Analítica V Análise Instrumental. Aula 11 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

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1 Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) Instituto de Ciências Exatas Depto. de Química QUI 070 Química Analítica V Análise Instrumental Aula 11 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Julio C. J. Silva Juiz de Fora, 2014

2 Introdução Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é o tipo mais versátil e mais amplamente empregado de cromatografia por eluição. Na cromatografia líquida, a fase móvel é um solvente líquido, o qual contém a amostra na forma de uma mistura de solutos. O tipo de cromatografia líquida de alta eficiência é geralmente definido pelo mecanismo de separação ou pelo tipo de fase estacionária: (1) partição ou cromatografia líquido-líquido; (2) adsorção ou cromatografia líquido-sólido; (3) troca iônica ou cromatografia de íons; (4) cromatografia por exclusão; (5) cromatografia por afinidade; (6) cromatografia quiral. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tornou-se uma ferramenta analítica indispensável. Os laboratórios criminais e os programas de televisão policiais e forenses, como CSI, CSI Miami, Crossing Jordan e Law and Order, freqüentemente empregam a CLAE no processo de obtenção de evidências criminais.

3 Introdução Nos anos de 1960 que se desenvolveu a tecnologia para produzir e utilizar recheios com diâmetros de partículas tão pequenos como 3 a 10 µm. O termo cromatografia líquida de alta eficiência é sempre empregado para distinguir essa tecnologia dos procedimentos cromatográficos realizados em colunas simples que os precederam. A cromatografia de coluna simples, contudo, ainda encontra considerável uso para propósitos preparativos.

4 Instrumentação Cromatografia líquida moderna: Altas pressões de bombeamento velocidades razoáveis por recheios de partículas muito pequenas (3 10 µm) Equipamentos mais complexos Equipamentos mais caros

5 Instrumentação

6 Instrumentação

7 Reservatório de fase móvel Instrumentação Sistemas de tratamento de solventes Gases dissolvidos e material particulado devem ser retirados Desgaseificadores vácuo, sistemas de destilação, aquecimento e agitação e sistema de sparging Sparging sistema pelo qual os gases dissolvidos são arrastados para fora de um solvente por pequenas bolhas de um gás inerte e solúvel Sistema de Eluição: Isocrático constituição do solvente permanece constante Gradiente composição do solvente é alterada

8 Instrumentação

9 Instrumentação Sistema de Bombeamento Requisitos: Habilidade de gerar pressões altas (até psi) Saída livre de pulsação Vazões na faixa 0,1 10 ml/min Reprodutibilidade relativa da vazão de 0,5% ou melhor Resistência a corrosão Tipos de bomba: De seringa Bomba recíproca Bomba pneumática de pressão

10 Instrumentação Sistema de Bombeamento Bomba de seringa (rosca): Saída livre de pulsação Pequena capacidade de volume ( ± 250 ml) Troca de solventes difícil Bomba recíproca: Fluxo pulsado que deve ser atenuado Pequeno volume interno Alta pressão de saída ( spi) Eluição por gradiente Vazões constantes Bomba pneumática de pressão Barata Simples Livres de pulsação Eluição por gradiente não permite

11 Instrumentação

12 Instrumentação Sistema de Injeção da Amostra Alça de amostragem Permite a escolha do volume (5 a 500 µl) Boa precisão Auto-amostradores

13 Aço inoxidável Instrumentação Colunas para cromatografia Comprimento 10 a 30 cm Diâmetro 2 a 5 mm Recheio partículas de 3 10 µm Microcolunas d.i = 0,1-5 mm, l = 3 8 cm, recheio = 3 5 µm Vantagens: Maior eficiência da coluna Menor consumo de solventes Maior velocidade de eluição

14 Instrumentação Colunas para cromatografia Microcolunas exemplo:

15 Instrumentação Colunas para cromatografia Recheio Sílica (suporte) partículas com diâmetros altamente uniformes Fase estacionário composto orgânico química ou fisicamente ligados a superfície do suporte. Colunas de proteção (guarda) Posicionada a frente da coluna analítica Função aumentar a vida útil da coluna analítica Composição semelhante a composição da coluna analítica Termostato para coluna manter a temperatura sob controle.

16 Instrumentação Detectores Pequeno volume morto Pequeno e compatível com a vazão de líquido Não existe detector universal Tipos de detectores:

17 Instrumentação Detectores

18 Instrumentação

19 Tipos de CLAE (partição) Cromatografia por partição a fase estacionária é um líquido imiscível com a fase móvel Cromatografia por partição líquido-líquido FE é um solvente que é imobilizado por adsorção Cromatografia por partição com fase ligada FE é um composto orgânico imobilizado por ligações químicas Amplamente empregada

20 Tipos de CLAE (Partição) Recheios com fase ligada FE diferentes polaridades Características: Maior estabilidade Compatível com CLAE por gradiente Pequena capacidade de amostra Recheios de Fase Normal e Reversa Fase normal A FE é polar e a fase móvel é apolar Fase reversa A FE é apolar e a fase móvel é polar

21 Tipos de CLAE (Partição) Escolha das Fases Móvel e Estacionária Regra geral: iguala-se a polaridade do analito com a da FE Usas-se uma FM com polaridade diferente da FE Analito e FM com polaridades semelhantes não é vantajoso... Analito e FE com polaridades muito parecidas também não é vantajoso...

22 Aplicações: Tipos de CLAE (Partição)

23 Aplicações: Tipos de CLAE (Partição)

24 Tipos de CLAE (Adsorção) CLAE por adsorção Os analitos são adsorvidos sobre uma superfície de um sólido polar finamente dividido (recheio) A FM é constituída por um solvente orgânico ou por uma mistura de solventes orgânicos A FE é composta por partículas de sílica ou alumina

25 Tipos de CLAE (Troca Iônica) Existem dois tipos Baseadas em supressores e coluna única Cromatografia de íons baseadas no uso de supressores: Detector de condutividade sensíveis, universais para espécies carregadas, simples, baixo custo e fáceis de serem miniaturizados Limitação alta concentração de eletrólito para eluição da maioria dos íons dos analitos Conseqüentemente alta condutividade e baixa sensibilidade Porém, em

26 Tipos de CLAE (Troca Iônica) Porém, em Coluna supressora de eluente coluna recheada com uma resina trocadora de íons que converte os íons do solvente de eluição para espécies moleculares de ionização limitada Na determinação de cátions: Na determinação de anions:

27 Tipos de CLAE (Troca Iônica) Supressora Coluna

28 Tipos de CLAE (Troca Iônica) Coluna de guarda

29 Tipos de CLAE (Troca Iônica) Fluoreto Cloreto Sulfato

30 Tipos de CLAE (troca iônica)

31 Tipos de CLAE (Exclusão) O fracionamento é baseado nos tamanhos das moléculas Filtração em gel recheio hidrofílico (espécies polares) Permeação em gel recheio hidrofóbico (espécies apolares)

32 Aplicação: Tipos de CLAE (Exclusão)

33 CLAE versus CG

34 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Silva, L.L.R. Notas de Aula. FACET, UFVJM, Cadore, S. Notas de Aula. IQ, UNICAMP, SKOOG, D. A; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A., Princípios de Análise Instrumental, 5ª edição, Editora Bookman, COLLINS, H. C.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S., Fundamentos de Cromatografia, Editora Unicamp, 2006.