Introdução às técnicas de separação e cromatografia
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1 Introdução às técnicas de separação e cromatografia Prof. Aloísio J.B. Cotta acotta@ceunes.ufes.br CAP. 30 do SKOOG. Separações As separações isolam o(s) analito(s) dos constituintes potencialmente interferentes. separações podem ser completas ou parciais Separação completa A C B D Mistura ABCD A Separação parcial Mistura ABCD Mistura BCD 1
2 Sinal 19/11/2014 Um interferente é uma espécie química que produz um erro sistemático em uma análise seja apelo pelo aumento ou atenuação do sinal analítico ou pela alteração do sinal de fundo. Isto é, o interferente corrompe a relação sinal analítico Vs concentração. Concentração O objetivo de uma separação é eliminar (ou reduzir) o interferente para que a informação analítica quantitativa sobre o(s) analito(s) de possa ser obtida. Adicionalmente, a separação pode servir para concentrar espécies em baixos níveis. Em técnicas como a cromatografia, a informação quantitativa é obtida quase simultaneamente à separação. (Combina: separação+detecção) 2
3 SEPARAÇÃO POR PRECIPITAÇÃO As separações por precipitação requerem uma grande diferença de solubilidade entre o analito e os interferentes. A coagulação de precipitados coloidais, pode ser difícil ou lenta. Separação por controle do ph. Fe 2+, Mg 2+, Zn 2+ Kps: Fe(OH) 2 =8x10-15, Mg(OH) 2 =9x10-12, Zn(OH) 2 =2x
4 SEPARAÇÃO POR PRECIPITAÇÃO Separação via controle do ph. Fe 2+, Mg 2+, Zn 2+ Kps:Fe(OH) 2 =8x10-15, Mg(OH) 2 =9x10-12, Zn(OH) 2 =2x10-17 ph correspondente a solubilidade (p/ iniciar a precipitação): 2x10-17 =x*(2x) 2 [OH - ]=3,42x10-6 M ph=10,5 poh=5,5 e ph=8,5 ph= 9,4 Al(OH) 3 Kps= 2,7x10-32 ph=6,2 Começa a precipitar Dificuldades: Coprecipitação, formação de complexos solúveis p.ex.: Al(OH) 4 - Apenas mostrar para estudo em casa... ph = 14 poh ph = 14 (-log(3x10-12 )) ph = 2,5 começa ppt Fe(OH) 3 4
5 ph = 14 poh ph = 14 (-log(8,4x10-6 )) ph = 8,9 começa ppt (Mg(OH) 2 Exemplo: Determinação de ferro em solo 0,485g de uma amostra de solo teve seu Fe 2+ e Fe 3+, extraído e oxidado para Fe 3+. Este foi precipitado como óxido de ferro hidratado (Fe 2 O 3.xH 2 O). O precipitado depois de filtrado, lavado e calcinado pesou 0,248g, com o ferro na forma de oxido (Fe 2 O 3 ). Qual o conteúdo de Ferro na amostra? Dados do problema: m amostra = 0,485g m Fe2O3 = 0,248g MM Fe = 55,847g MM Fe2O3 = 159,690g Resposta: % Fe = 35,7 % 5
6 Separações por outros precipitantes Inorgânicos e Orgânicos Os íons PO 3-4, CO 2-3 e oxalato (C 2 O 2-4 ) são freqüentemente empregados como precipitantes para cátions, porém seu comportamento não é seletivo. Cl - é útil para Ag + de muitos outros metais, e o SO 4 2- para isolar o Pb 2+, Ba 2+, Sr 2+. Dimetilglioxima ou 8-hidroxiquinolina é considerado especifico para Ni. EXEMPLO: Determinação de cálcio em águas naturais (método recomendado pela AOAC Association of Official Analytical Chemists) 6
7 Exercício: 100,0 ml de amostra são tratados com solução de oxalato de sódio para precipitação do oxalato de cálcio. O qual foi coletado por filtração e calcinado a 550º C por 2 h, e obtevese 135 mg de CaO. Calcule a concentração de Ca 2+ na amostra. MM CaO = 40,08+16 = 56,08 g/mol 56,08 g mol 0,135 g X X= 0, mol de CaO, como cada CaO contém um Ca, temse que o nº de mols deca é igual a de CaO. [Ca 2+ ] = nº de mol/volume = 0, mol/0,1 L = 0,0241 mol/l 7
8 SEPARAÇÃO POR EXTRAÇÃO Se a extensão da distribuição dos solutos entre duas fases líquidas imiscíveis difere significativamente, essa diferença pode ser empregada na separação das espécies químicas. Partição de um soluto entre duas fases líquidas imiscíveis (lei de distribuição) K = constante de distribuição 8
9 Cálculo da concentração do analito que permanece em solução aquosa [A] i após um número i de extrações: EFICIÊNCIA 98,84 % 99,94% 99,9999% É sempre melhor empregar pequenas porções do solvente em várias extrações do que extrair com uma única porção de maior volume. 9
10 Eficiência (%) 19/11/ x50ml 2x25ml 5x10ml Número de extrações Eficiência das extrações para o problema anterior. 1 = (50/(25*K+50)) 2 *100 (1/100) 1/2 = [(50/(25K+50) 2 ] 1/2 0,100 = 50/(25K + 50) K = 18,0 10
11 DTC PROCEDIMENTO: 80ml de água do mar ph ajustado p/ 4,5 (Tampão CH 3 CO 2 NH 4 /CH 3 CO 2 H) 0,1 ml 0,5% Dietilditiocarbamato de Sódio (DTC) (agente complexante) 5 ml de DIBK (Diisobutil cetona) fase orgânica para extração 1 ml de Hg + (100ppm) foi usado p/ liberar os metais da fase orgânica DIBK 11
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14 SEPARAÇÃO DE ÍONS POR TROCA IÔNICA Na troca iônica, íons presos num sólido poroso e insolúvel são trocados por íons presentes em uma solução em contato com o sólido resinas sintéticas trocadoras de íons Resinas sintéticas trocadoras de íons: ácidos sulfônicos(--so 3 - H + ) ligados à matriz polimérica Passagem de uma solução contendo Na + (aq) pela resina Na + solução leva os H + (aq) Na + 14
15 As resinas trocadoras são polímeros de alto peso molecular que contêm um grande número de grupos funcionais iônicos por molécula. Epicloridrina Bisfenol A RESINA EPOXY Resina Fenólica Os trocadores do tipo ácido forte apresentam grupos ácidos sulfônicos ( SO 3- H + ) ligados à matriz polimérica e têm aplicação mais ampla aplicação do que os trocadores tipo ácido fraco (grupos carboxílicos COO - H + ). Resina De forma similar, os trocadores de ânions do tipo base forte possuem grupos amínicos quaternários [ N(CH 3 ) 3+ OH - ], enquanto os do tipo base fraca contêm aminas secundárias e terciárias. 15
16 M + pode ser Ca 2+, Zn 2+, K +, Cu 2+, Pb 2+, etc A - pode ser Cl -, F -, NO 3-, PO 4 3-, SO 4 2- etc Vamostra = 25,0 ml Os cátions da amostra são retidos na resina e trocados por H +, que é então titulado com 15,3 ml de NaOH 0,0202 mol/l. Qual o número de moles de H + na porção titulada? TITULAÇÃO (1:1): H + +OH - =H 2 O n H+ = n OH- n H+ = C V n H+ = 15,3*0,0202 = 0,31 mmol [H + ] = 0,31 (mmol)/0,025 (L) [H + ] = 12,4 mmol/l, como cada H + tem uma carga positiva, temos 12,4 miliequivalente de carga. 16
17 Vídeos em inglês nsf/content/protein_purification~educ ation~ion_exchange# ou er_embedded&v=q3fmqgt1do8 05/5-5.html SEPARAÇÕES CROMATOGRÁFICAS A cromatografia é um método que permite a separação, identificação e determinação de componentes químicos em misturas M. complexas. TSWEET (1903): Separação de misturas de éter de petróleo pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados. mistura de pigmentos CaCO 3 pigmentos separados Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever] (grego) 17
18 Solução da amostra Solução eluente Compostos amostra Coluna A B CROMATOGRAFIA Princípio Básico Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás). Azul é mais fortemente Retido na Fase estacionária (FE) CROMATOGRAMA Tempo 18
19 Todas as técnicas cromatográficas apresentam em comum o uso de uma fase estacionária e de uma fase móvel. Os componentes de uma amostra são transportados através da fase estacionária pelo fluxo da fase móvel e as separações ocorrem com base nas diferentes velocidades de migração dos componentes da amostra. Uns sendo eluídos mais rapidamente do que outros. 19
20 Dois componentes de uma amostra, A e B, são separados por eluição em uma coluna recheada contendo a fase estacionária (FE). A fase móvel (FM) transporta os componentes com diferentes velocidades através da fase estacionaria. Qto maior a afinidade do soluto pela FE maior seu tempo de retenção. As posições dos picos (tempo de retenção) num cromatograma são empregadas para identificar os constituintes da amostra e as áreas sob os picos provêm uma medida quantitativa de sua concentração. Qual espécie (A ou B) tem maior afinidade pela FE? 20
21 Constantes de Distribuição (Kc) As separações cromatográficas estão baseadas em diferenças de afinidade dos analitos entre a fase móvel (FM) e a fase estacionária (FE). Analito1 (FM) Analito1 (FE) Analito2 (FM) Analito2 (FE) Analito3 (FM) Analito3 (FE) Kc1= [Analito1] FE / [Analito1] FM Kc2= [Analito2] FE / [Analito2] FM Kc3= [Analito3] FE / [Analito3] FM Como Kc1 Kc2 Kc3 temos diferentes afinidades pela FE, assim temos diferentes tempos de retenção para cada analito. Tempo de Retenção O tempo morto fornece a velocidade média de migração da fase móvel tempo de retenção (t R ), t E tempo de retenção corrigido pelo tempo de eleição da fase movel (t M ). 21
22 Fator de seletividade Fator de retenção (k) 1 min 10 min 14 min Calcule o α α = (14-1/(10-1) =13/9 =1,4 Número de Pratos (N) em uma Coluna e Altura do Prato (H) Um prato representa uma etapa de equilíbrio entre FM e FE. H = L/N L= comprimento da coluna 22
23 Resolução de uma Coluna A resolução (Rs) de uma coluna nos diz quanto duas bandas se distanciam uma da outra em comparação com as suas larguras. EXERCÍCIO: Cálculo da resolução de uma coluna na separação de A e B. 23
24 15 min 21,7 min 24
25 ΔZ 20 min EXERCÍCIO: Cálculo da resolução de uma coluna na separação de A e B. Banda A; Largura (W) =15 min Banda B; Largura (W) = 21,7 min ΔZ =20,0 min Rs=20/(15/2+21,7/2) =1,09 1,1 25
26 A resolução é uma medida quantitativa da habilidade da coluna em separar dois analitos. EXERCÍCIO 26
27 EXERCÍCIO Assumindo que a resolução é proporcional a raiz do numero de pratos teóricos (N). Otimização A otimização das condições cromatográficas busca obter uma separação completa dos analitos num menor tempo possível. Alteração da fase móvel 27
28 O Problema Geral da Eluição Cromatogramas para 3 pares de componentes muito diferentes, com ampla diferença nos tempos de retenção as bandas de 5 e 6 aparecem alargadas e após um longo intervalo. a alteração das condições encurta o tempo de eluição, mas afeta a resolução. A alteração das condições cromatográficas durante a análise permite encurtar o tempo de eluição e manter uma boa resolução. (CORRIDA não ISOCRÁTICA) Em cromatografia líquida, altera-se a composição da FM, denominado eluição por gradiente. Em cromatografia gasosa, a temperatura do forno pode ser alterada obedecendo a uma programação de temperatura acetonitrila 28
29 Cromatografia em Camada Delgada Cromatografia: um Breve Ensaio th a non-polar solvent. Cromatografia em Coluna Volume para adição de F.M. Não deve deixar secar, por isso o Volume para adição de FM. Areia Sorvente (F.E.) Sílica (SiO 2 ) Alumina (Al 2 O 3 ) Areia Algodão/plug Areia, previne perturbações na FE, mantendo seu empacotamento. Adicione FM com cuidado e de modo a obter uma vazão constante. Pode-se coletar as frações, após a separação dos compostos Com FE de sílica ou alumina compostos polares são mais retidos do que os apolares, por isso, os menos polares são eluídos primeiro. Compostos polares são eluídos por solventes polares. 29
30 Camada delgada ou Papel Vs Cromat em Coluna A é o composto MENOS polar A maior arraste pela FM R f(a) > R f(b) A eluído mais rapido pela FM. Menor tempo de retenção. 1) Qual ao objetivo principal de se incluir uma etapa de separação num método analítico? 2) Por que a separação é importante num método analítico quantitativo, quais outros ganhos podem estar associados? 3) Esboce o cromatograma (CCD de sílica) da separação das misturas de compostos em (a) e (b). Alcanos 2 (- polar) a) Benzeno 2,3 Éter dietílico 4,3 Clorofórmio 4,7 Acetato de etila 6 Diclorometano 9 Acetona 21 Etanol 24 Metanol 33 Água 78* (+polar) * Constante dielétrica b) 30
31 Exercícios do cap. 30 estão marcados em amarelo. Desconsiderar as partes grifadas em vermelho. 31
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