Profa. Dra. Milena Araújo Tonon

Transcrição

1 Profa. Dra. Milena Araújo Tonon

2 Cromatografia Planar C O L U N A Líquido Líquido Gás Fluido super crítico CP CCD CCC CLAE CG CFSC

3 M. TSWEET (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados. FM: éter de petróleo mistura de pigmentos FE: CaCO 3 pigmentos separados

4 A Cromatografia líquida clássica é uma técnica muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificação de produtos de reações químicas. Esta consiste de no uso de uma coluna, de maneira geral constituída por um tubo de vidro em posição vertical na qual a parte superior é aberta e a inferior afunilada podendo ou não conter uma torneira de controle de vazão da FM. A FE que fica no interior da coluna é suportada por um chumaço de algodão ou lã de vidro que impede a perda de FE permitindo a passagem da FM e a eluição da amostra. As dimensões da coluna dependem da quantidade de material a ser cromatografado.

5 De maneira em geral a coluna é constituída de vidro, em posição vertical, a extremidade superior é aberta e a inferior afilada. As dimensões da coluna dependem do material a ser cromatografado. Os adsorventes mais utilizados são a sílica e a alumina

6 A principal etapa ao se utilizar essa técnica é o empacotamento, o qual, entre outros fatores, definirá a eficiência da separação. À coluna adiciona-se uma pequena quantidade de solvente e deposita-se na sua extremidade inferior um chumaço de algodão com espessura de aproximadamente 0,5 cm para impedir a passagem de partículas da fase estacionária. A adição de sílica deve ser feita com a torneira semi-aberta. O adsorvente é adicionado lentamente à coluna fixada na posição vertical, batendo-se continuamente ao longo da mesma para que todo o ar seja expulso, de modo a se obter uma compactação uniforme.

7 A existência de ar entre as partículas leva à formação de canais na coluna, os quais prejudica a análise uma vez que alargam as bandas eluídas. Nunca se deve permitir que o nível do solvente desça abaixo do nível do adsorvente, o que poderia acarretar rachaduras, comprometendo a eficiência da coluna. Após o empacotamento, é conveniente que se passe certa quantidade do eluente (duas a três vezes o volume da coluna) a ser utilizado através da coluna antes da introdução da amostra. Esta é adicionada à coluna com o auxílio de uma pipeta no momento em que o nível do eluente esteja o mais próximo possível do adsorvente. Esse procedimento ameniza o alargamento das bandas a serem eluídas.

8 Tendo a amostra penetrado no adsorvente, o eluente é então adicionado cuidadosa e continuamente. A eluição se processa por ação da gravidade. A FM ao passar pelo adsorvente arrasta consigo os componentes da amostra. Frações são recolhidas separadamente para posterior análise qualitativa e quantitativa das amostras. As fases estacionárias mais utilizadas são sílica e alumina. Fases estacionárias sólidas levam à separação por adsorção e fases estacionárias líquidas por partição. Suportes quimicamente modificados também têm sido usados, sendo o processo de separação misto neste caso. Outros adsorventes de uso comum são o silicato de magnésio, o óxido de magnésio, carvão, dextrana e polímeros de estireno.

9 Preparo da coluna Suspensão da FE na FM Adiciona-se a suspensão na coluna contendo um pouco de FM Abaixar o nível de FM (abrir a torneira da bureta) Vibrar, bater levemente, na coluna para empacotá-la, para sedimentar a FE de forma homogênea Aplicar a amostra Desenvolvimento: aplicação da FM para eluição dos compostos de interesse

10 As substâncias eluirão da coluna segundo sua polaridade. A sílica e a alumina dão exemplos de FE polar, assim irão reter mais substâncias polares. Na escolha da FM devem ser escolhidas as substâncias que conseguem dessorver o analito levando em consideração que quanto mais parecida FM é da FE mais forte ela é. Assim, por exemplo, com FE polares, a dessorção é facilitada quando se usa um eluente polar. Outros fatores importantes é que a FM não afete quimicamente a FE, seja fracamente adsorvida pela FE e possibilite o desenvolvimento da corrida cromatográfica. No modo normal, com FE polares como a sílica e a alumina, um aumento na polaridade da FM resulta em uma eluição mais rápida dos componentes da mistura. No modo reverso, com FE, por exemplo, de estirenom/divinilbenzeno, a força da FM aumenta diminuindo sua polaridade.

11 A separação pode ser feita utilizando o modo isocrático, ou seja com uma única composição de FM ou no modo de eluição por gradiente. Neste ultimo diferentes composições de FM são utilizadas a fim de eluir mais rapidamente compostos muito retidos. As frações coletadas podem ser analisadas empregando outras ténicas.

12 Tipos de desenvolvimento Eluição isocrática: a composição da FM é mantida constante durante a análise FM: hexano: acetato de etila (7:3) Eluição por gradiente: força da fase móvel é aumentada FM: hexano: acetato de etila (9:1) FM: hexano: acetato de etila (7:3) FM: hexano: acetato de etila (5:5)

13 Porque utilizar a eluição por gradiente?

14 Análise qualitativa: CCD, espectrofotometria de UV-Vis, infravermelho, etc Análise quantitativa: utilizar curva de calibração e coletar frações com volume definido

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16 A espectroscopia avalia a interação da radiação eletromagnética através da quantidade de radiação produzida ou absorvida pelas moléculas. Os métodos são classificados de acordo com a faixa do espectro eletromagnético envolvida na análise. Quando essa energia atravessa uma solução contendo átomos e moléculas presentes em uma cubeta (recipiente contendo a solução) parte da radiação é absorvida. A quantidade absorvida está relacionada com a concentração da solução. A absorção nessa região dependerá também da estrutura da molécula, ocorrendo principalmente nos sistemas conjugados.

17 A cromatografia em coluna seca é um processo de eluição não concluído na qual os componentes da amostra permanecem no interior da coluna após a separação. Uma das extremidade da coluna é fechada e na outra adiciona-se a FE, seguida amostra e a pela FM até que a sua linha de frente atinja a base da coluna. A coluna é exposta a luz ultravioleta para visualização das separações. A coluna cortada em fatias de acordo com a separação e os analitos separadamente eluidos com solventes apropriados.

18 Na separação podem ser empregados diferentes mecanismos que podem ser classificados em: adsorção, partição, troca iônica, exclusão e bioafinidade. Na cromatografia de adsorção as separações ocorrem através de interacções electrostáticas e forças de Van Der Waals entre a fase estacionária (sólido) e os componentes a separar da fase móvel (líquido ou gás). A natureza da fase estacionária pode ser muito diversa, nomeadamente sílica gel, alumina ou celulose. O fracionamento por cromatografia de interação hidrofóbica em coluna, sobretudo de misturas contendo espécies não iónicas solúveis em solventes orgânicos, é essencialmente determinado por diferenças de polaridade dos componentes na mistura a resolver.

19 Adsorção Muitos adsorventes utilizados em cromatografia em coluna são também utilizados em CCD. A sílica e alumina são os mais empregados, sendo utilizado também adsorventes como silicato de magnésio, óxido de magnésio, carvão, dextrana e polímeros de estireno. A FM deve promover o desenvolvimento dos componentes da mistura na coluna e remover ou desorver esses componentes do adsorvente seletivamente. Fase Normal: FE sílica, alumina, etc Fase reversa: FE polímero de estiremo/divinilbenzeno

20 A cromatografia de partição é baseada nas diferenças de solubilidade dos componentes na fase estacionária (líquido) e na fase móvel (líquido). O principal emprego desse mecanismo se dá na cromatografia em papel uma vez que a celulose é constituída por várias unidades de glicose anidra, ligadas por átomos de hidrogênio A água tem grande afinidade com as hidroxilas de cada glicose fazendo ligação de hidrogênio. Desta forma a água funciona como FE e os líquidos menos polares (solventes orgânicos) são repelidos por esta estrutura e funcionam como FM. Assim os componentes menos solúveis na FE tem movimentação mais rápida ao longo do papel, enquanto os mais solúveis na FE serão seletivamente retidos, tendo uma movimentação mais lenta. Na CCD o principal mecanismo é o de adsorção. Esta pode seguir o mecanismo de partição quando sua FE for de celulose.

21 Partição Partição : Diferença de solubilidade do componente da amostra na FM e FE FM : líquida (ACN:água) FE : líquida (suporte de celulose FE: água) Em caso de suporte de celulose o mecanismo é o de partição

22 A cromatografia de exclusão molecular, denominada também como filtração em gel ou separação por peneiros moleculares, separa os componentes segundo o tamanho efectivo (raio hidrodinâmico) das moléculas, isto é, moléculas grandes não penetram no interior do suporte (partículas porosas de gel) e movem-se mais rapidamente ao longo da coluna de onde emergem primeiro, enquanto as moléculas pequenas vêm a sua velocidade de deslocamento retardada porque penetram no gel, portanto, emergem da coluna mais tardiamente. O recheio ou gel é constituído de macromoléculas que tem ligações cruzadas, com afinidades pelos solventes, mas que neles são insolúveis.

23 O espaço entre as partículas é ocupado por um liquido que flui pelo material. O gel deve suportar uso contínuo de ph e tempertura, conter articulas de tamanho e distribuição controlados, rigidez mecânica para não ser deformado pelas forças causadas pelo fluxo do liquido através da coluna. Tipos de gel: gel de dextrana, gel de poliacrilamida, gel de Agar e agarose. Uso para determinação da massa molar de polímeros naturais ou sintéticos; determinar a massa molar de proteínas nativas ou desnaturadas, separar moléculas com massas moleculares próximas, etc.

24 Exclusão Separação é baseada no tamanho das moléculas FE: líquida FM: líquida Suporte(gel ou similar) não é a FE, apenas fornece os poros nos quais se dá o mecanismo de distribuição. Essa distribuição é a do soluto entre a FM dentro e fora dos poros. A separação depende dos limites de exclusão do gel

25 Gel adequado para cromatografia por exclusão deve ser: Inerte quimicamente Estável Tamanho de poro adequado Rigidez mecânica Tamanho e uniformidade das partículas FM: deve dissolver a amostra, ter baixa viscosidade e ser compatível com o recheio. Exemplos: gel de dextrana (polissacarídeo da fermentação da sacarose)- Sephadex: dextrano polimerizado gel de poliacrilamida (bio-gel) Poliestireno: separação de substâncias lipofílicas usando solventes orgânicos.

26 Na cromatografia de troca iônica, a FE é altamente carregada, e solutos com cargas de sinais contrários a esta são seletivamente adsorvidos da FM. Os solutos adsorvidos podem ser depois eluídos por deslocamento com outros íons com a mesma carga porém com força maior de interação com a FE. Os diferentes graus de afinidade eletrostática entre o trocador e os íons da FM regem esse tipo de cromatografia. A separação de materiais por cromatografia de troca iônica está baseada na adsorção reversível e diferencial dos íons da FM pelo trocador da matriz. A diferença de afinidade entre os íons da FM e a matriz é devido a diferenças de carga, sendo possível controlá-la utilizando fatores como ph e a força iônica.

27 Troca iônica Competição entre os componentes carregados da amostra e da FM pelos sítios carregados na FE ( FE: sólida ; FM: líquida) Fase estacionária : trocadores iônicos Trocador aniônico (+) Trocador catiônico (-) Trocador catiônico forte: carga (-) em qualquer ph Trocador catiônico fraco: carga (-) em meio básico Trocador aniônico forte: carga (+) em qualquer ph Trocador aniônico fraco: carga (+) em meio ácido

28 Na cromatografia de afinidade ocorre uma ligação molecular específica e reversível entre o soluto e um ligante imobilizado na fase estacionária. Esta técnica utiliza-se especificamente para separar produtos biológicos, e como exemplos podemos citar: ligações enzimas e substractos, anticorpos e substractos e recepetores de hormonas. Baseada nas propriedades biológicas ou funcionais das espécies que itneragem. Primeiro trabalho descrito 1951por Campbell e colaboradores. O grande impulso dessa técnica foi em através dos trabalhos de Cuatrecasas e colaboradores.

29 A metodologia da cromatografia por bioafinidade consiste no preparo de uma FE seletiva, por imobilização à matriz ou suporte sólido. A amostra é aplicada à coluna contendo o ligante. As molécula que não possuem afinidade com o ligante passam pela coluna sem serem retidas. A eluição das moléculas ligadas pode ser feita por alguma alteração, como por exemplo ph, temperatura, força iônica, solvente específico que tornam o complexo molécula ligante menos estável e assim é coletada a amostra de interesse. Exemplos de matrizes: matriz de agarose, matriz de celulose, matriz de dextrana, matriz de poliacrilamida, matriz de trisacril. A preparação da FE consiste na ativação da matriz e o subsequente acoplamento do ligante. Exemplos de resinas comercialmente disponíveis: ligantes: fenil, avidina, heparina, coenzima A, etc.

30 Bioafinidade Baseia-se nas propriedade biológicas e funcionais das espécies que interagem: a substância a ser separada e a FE Ligante Específico: liga-se com apenas uma espécie de antígeno/anticorpo Geral: liga-se a um grupo específico presente em várias moléculas Ex: glicoproteína Substância alvo Ligante Eluente Celulase Celulose Temperatura Flavoquinase Flavinas Riboflavina 3B-hidroxiesteróide oxidase colesterol Triton X-100

31 As moléculas que não possuem nenhuma afinidade com o ligante da FE passam pela coluna sem serem retidas A eluição das moléculas ligadas pode ser feita com alteração de ph e /ou força iônica do meio por uso de um solvente específico ou ainda modificação na temperatura Amostra Enzima Anticorpo Lecitina Ácido nucléico Hormônios Tipo de ligante Substrato, co-fator, inibidor Antígeno Polissacarideo, glicoproteína Sequência de base complementar receptor