Enzimas Imobilizadas. EQB4383 Enzimologia Industrial. M.A.Z. Coelho

Transcrição

1 Enzimas Imobilizadas

2 DEFINIÇÕES E HISTÓRICO Entende-se por enzima imobilizada, aquela física ou quimicamente associada a um suporte ou matriz, usualmente sólida, insolúvel em água e inerte, que não seja essencial a sua atividade. Objetivos da imobilização : 1- Reutizar a enzima 2-Aumento da estabilidade

3 Histórico do Uso de Enzimas Imobilizadas ocorreu a primeira utilização de enzima imobilizada (invertase em carvão vegetal) por Nelson e Griffin Katchalski introduziu os primeiros suportes úteis os processos com enzimas imobilizadas também têm utilização industrial em larga escala - aminoacilase imobilizada em DEAE Sephadex para produção L-aminoácidos. Maior uso de enzimas imobilizadas é na produção de xaropes de frutose através da glicose-isomerase imobilizada é realizada em grande escala nos Estados Unidos

4 USOS EM ESCALA INDUSTRIAL DAS ENZIMAS IMOBILIZADAS Resolução de Misturas Racêmicas de Aminoácidos aminoacilase - tanto L como D-aminoácidos são completamente convertidos a L-aminoácidos. Produção de Ácido 6-Aminopenicilâmico (6-APA) peniclina amidase e suporte bentonita entrecruzada. Produção de leites e soros deslactosados lactase imobilizada em fibras de acetato de celulose ou vidro poroso ativado. Produção de xaropes de frutose a partir de glicose glicose isomerase utilizando como suporte proteínas entrecruzadas ou vidro poroso ativado.

5 Vantagens e Desvantagens Vantagens Desenvolvimento de sistemas contínuos Maior estabilidade enzimática Uso mais eficiente do catalisador através de reutilizações Flexibilidade no projeto de reatores Efluentes livres de catalisadores Maior versatilidade na etapa de separação Menor custo de mão de obra Facilidade de Automação e controle Possibilidade de utilização das enzimas in-natura Desvantagens Custo adicional de suportes, reagentes e da operação de imobilização Perdas de atividade durante a imobilização Possíveis exigências adicionais de purificação do catalisador Técnica pouco adequada a substratos insolúveis ou de alto peso molecular Maiores riscos de contaminação na operação contínua dos reatores Restrições difusionais e impedimento estéreo

6 ESCOLHA DE MÉTODOS E DO SUPORTE DE IMOBILIZAÇÃO Dependerá das características da enzima e das condições de uso da enzima imobilizada. Para uma escolha econômica do método de imobilização é necessário o conhecimento da reação desejada, o processo de aplicação da enzima imobilizada, condições do meio, modificações causadas na estabilidade, atividade, ph e demais fatores. O binômio suporte método mais adequado será aquele que propiciar uma maior atividade após imobilização.

7 Atividade da esterase de Bacillus subtilis imobilizada em vários suportes e por diferentes métodos SUPORTE MÉTODO POROS ( A) UI/g Acetato de celulose Microencapsulamento 0,02 45 Poliacrilamida Microencapsulamento 2,5 50 Pérolas de vidro Ligação covalente 0,2-1,0 200 DEAE-Sephadex A25 Adsorção 0,1 650 Dowex 1X1 Adsorção 0,4 820 DEAE- Celulose Adsorção 0,

8 Suportes de Imobilização Os suportes podem ser orgânicos ou inorgânicos, sintéticos ou naturais. Suportes necessitam de mudanças ou inclusão de grupos reativos ativação do suporte. Classificação dos suportes utilizados na Imobilização de Enzimas TIPO DE SUPORTE MATERIAIS POROSIDADE ESTABILIDADE Não poroso Vidro, sílica, aço - Alta Microencapsulado Triacetato de celulose 35 A Moderada Entrelaçado Poliacrilamida, PVP Variada Baixa Macroporoso Alumina, sílica A alta

9 Tipos de Suporte para Imobilização Vidro sílica Alumina Poliacrilamida Fibra de casca de coco tela de nylon

10 Critérios para avaliação de um sistema enzima-suporte Estabilidade de fixação a enzima deve estar bem fixa ao suporte. Estabilidade enzimática a enzima não deve sofrer modificações como desnaturação. Resistência mecânica o suporte deve resistir a várias condições desfavoráveis como, o peso do suporte dentro do reator. Capacidade de carga o suporte deve fixar um número elevado de unidades enzimáticas por unidade de área - um pequeno reator uma grande capacidade catalítica.

11

12 Por Oclusão ou Aprisionamento - encapsulamento Oclusão em matrizes: Podem ser géis (amido, borracha, nylon, poliacrilamida, sílica, alginato de cálcio, agarose, polietileno glicol) ou fibras. Nos géis ocorre o aprisionamento da enzima nos espaços intersticiais da rede polimérica (enzima confinada no interior de micelas), enquanto que nas fibras o aprisionamento se dá nas micro-cavidades. Métodos de Imobilização da enzima por encapsulamento em gel de ágar

13 Microencapsulamento: A enzima é oclusa em membranas poliméricas de porosidade de 300 µm (celulose, policarbonato, colágeno, politereftalato, polímeros em geral), semi-permeáveis esféricas de pequeno diâmetro. Microencapsulamento de enzima em material polimérico

14 Reticulação ou Ligação Cruzada Método que envolve o uso de agentes bifuncionais ou multi-funcionais, em geral diaminas alifáticas (di-isocianato) ou glutaraldeído, que induzem a auto-reticulação das enzimas, resultando assim na formação de uma rede tridimensional de moléculas de enzima Ligação Covalente A ligação covalente se dá pela reação de grupos reativos do suporte, matrizes como vidro, cerâmica, polímeros sintéticos, celulose, nylon e alumina, ativado ou não, com os grupos funcionais da enzima ligação de grupos - NH 2, -COOH, -OH, -SH, entre outros, preferencialmente em condições fisiológicas brandas, baixa temperatura, baixa força iônica, ph ótimo e muitas vezes na presença do substrato, a fim de proteger o sítio ativo da enzima evitando que haja diminuição da atividade da mesma

15 Adsorção Física Utiliza força de Van der Waals; método simples que se baseia na adsorção física em superfícies sólidas, como alumina, carvão, argila, sílica gel, colágeno, vidro, por ligações iônicas, polares ou de Van der Waals. Ligação Iônica Ligação de grupos com cargas opostas através de forças eletrostáticas. Processo simples, suave e não deletério para a maioria das enzimas, sendo inclusive desprezíveis os efeitos difusionais. Ligação Metálica Forma quelatos pela ativação da superfície do suporte por meio do metal ou por seu óxido. Nos dois primeiros métodos por adsorção, as forças são fracas levando a pequenas modificações conformacionais na enzima e, conseqüente, possibilidade de dissolução da mesma (perda). De uma forma geral, os processos de imobilização por ligação são preferidos quando se confronta eficiência, apesar da inclusão em géis ou matrizes ser mais barato.

16 Imobilização de -amilase por adsorção física em carvão de casca de coco

17 EFEITOS CAUSADOS PELA IMOBILIZAÇÃO Retenção da Atividade Enzimática - algumas moléculas enzimáticas podem estar imobilizadas em uma configuração que impede completamente o acesso do substrato ao centro ativo; - o grupo reativo do centro ativo pode estar envolvido a ligação ao suporte (a proteção do sítio ativo da enzima através de um inibidor reversível durante a ligação pode resultar em aumento na retenção da atividade; - moléculas da enzima podem ter se ligado em uma configuração que as torne inativas; - as condições de reação no processo de imobilização podem causar desnaturação ou inativação.

18 Características cinéticas e parâmetros termodinâmicos para a invertase na forma solúvel e imobilizada em três diferentes suportes (alginato de cálcio, quitina e polietileno ativado, respectivamente) PARÃMETRO INVERTASE SOLÚVEL INVERTASE IMOBILIZADA Km 26,0 mm 8,1 mm 52,2 mm 32,2 mm Vmáx 1,10 U 0,25 U 0,74 U 0,32 U ph (para atividade máxima) ph (maior estabilidade) T (para atividade máxima) T (maior estabilidade) Ea (energia de ativação a 37 C) H (variação de entalpia a 37 C) 4,6 4,6 4,0 4,6 4,0-4,6 4,5 6,5 5,0 6,0 4, C 60 C 60 C 70 C C C C C 27,8 kj/mol 24,4 kj/mol 51,9 kj/mol 37,5 kj/mol 25,2 kj/mol 21,9 kj/mol 49,3 kj/mol 34,9 kj/mol G -13,6 kj/mol -13,9 kj/mol (variação de energia livre de -11,5 kj/mol Gibs a 37 C) -14,7 kj/mol S 0,125 kj/mol 0,115 kj/mol (variação de entropia a 37 C) 0,196 kj/mol 0,160 kj/mol

19 Efeitos Difusionais Quando a enzima é imobilizada, o substrato tem que difundir na solução através de um filme líquido estacionário presente nas superfícies do suporte e, se este é poroso, através dos poros até alcançar o sitio ativo das enzimas - pode restringir a taxa de reação velocidade de difusão do substrato < velocidade de transformação pela enzima Vmáx mais baixa não se atinge a saturação.

20 Resistência Difusional Externa Surgem devido ao fato de que o substrato deve ser transportado do seio da solução até a superfície de catalise, devendo, por conseguinte atravessar uma camada líquida, assim o consumo de substrato através da membrana líquida pode ser imaginado como resultado de um gradiente. A difusão do substrato e produtos dos centros ativos para a solução (ou vice-versa) ocorre através de mecanismos de difusão molecular e convectiva. Os efeitos de difusão externa afetarão o transporte de massa e podem ser minimizados tanto pelo aumento da agitação, caso de reatores continuamente agitados (CSTR), quanto pelo aumento do fluxo de substrato, caso do reator pistonado (PFR). Efeitos Difusionais Internos Surgem devido à movimentação do substrato no interior do meio catalítico - difusão e reação ocorre simultaneamente

21 Efeitos Microambientais A enzima ao ser imobilizada passa a ser circundada por um ambiente diferente do que quando estava livre, especialmente se a matriz ou suporte possui carga. Os efeitos de circunvizinhança, que dependem da natureza física e química do suporte, podem acarretar uma distribuição desigual do substrato, produtos e cofatores entre a região vizinha ao sistema imobilizado e o resto da solução. Efeitos Estereoespecíficos Existem situações onde a atividade da enzima frente a um substrato com elevado peso molecular é reduzida durante o processo de imobilização, de uma forma mais extensa que frente a um substrato com menor peso molecular - resultado de impedimento estéreo, formado pelo suporte, ao acesso de moléculas grandes ao centro ativo da enzima (impedimento estérico).