CONCEITO CONCEITO HISTÓRIA 21/03/2013

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1 CONCEITO Cromatografia é um processo físico de separação, no qual os componentes a serem separados distribuem-se em duas fases: fase estacionária e fase móvel. PROFA. ALESSANDRA GUEDES SALVADOR, Ela está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. CONCEITO A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido dispostos sobre um suporte sólido com grande área superficial. A fase móvel, que pode ser gasosa, líquida ou ainda um fluido supercrítico, passa sobre a fase estacionária, arrastando consigo os diversos componentes da mistura. HISTÓRIA O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilização é atribuída a um botânico russo ao descrever suas experiências na separação dos componentes de extratos de folhas. A passagem de éter de petróleo (fase móvel) através de uma coluna de vidro preenchida com carbonato de cálcio (fase estacionária), à qual se adicionou o extrato, levou à separação dos componentes em faixas coloridas. 1

2 HISTÓRIA CLASSIFICAÇÃO Provavelmente é o motivo pelo qual a técnica é conhecida como cromatografia (chrom= cor e graphie = escrita); podendo levar à errônea idéia de que o processo seja dependente da cor. Entretanto só a partir da década de 30 diversos trabalhos na área possibilitaram seu aperfeiçoamento e, em conjunto com os avanços tecnológicos, levaram-na a um elevado grau de sofisticação, o qual resultou no seu grande potencial de aplicação em muitas áreas. Classificação pela forma física do sistema cromatográfico: Cromatografia em coluna: Cromatografia Líquida clássica Cromatografia planar: Cromatografia em Papel e Cromatografia em Camada Delgada. CLASSIFICAÇÃO Classificação pela fase móvel empregada: Cromatografia Gasosa: Cromatografia Líquida Cromatografia Supercrítica CG Cromatografia Gasosa CGAR Cromatografia Gasosa de Alta Resolução CLC cromatografia Líquida Clássica CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLASSIFICAÇÃO Classificação pela fase estacionária Cromatografia por adsorção Cromatografia por Partição Cromatografia Troca Iônica Cromatografia por Exclusão 2

3 Cromatografia por Partição Baseia-se nas diferentes solubilidades dos componentes de uma mistura, em ambas as fases, as quais são as duas líquidas. Pode ser efetuada em papel ou em coluna como suportes. Cromatografia por Partição A Cromatografia em Papel (CP) é uma das técnicas mais simples e que requer menos instrumentos para sua realização, porém é a que apresenta as maiores restrições para sua utilização em termos analíticos. O coeficiente de partição é independente da concentração e de outras substâncias da mistura. FASE MÓVEL F. ESTACIONÁRIA Cromatografia por Papel Fator de Retenção(Rf) TECNICA: A amostra líquida flui por uma tira de papel adsorvente, este é constituído por moléculas de celulose que possui alta afinidade por água presente na mistura de solvente, mas muito pouca pela fase orgânica, atuando como suporte inerte contendo a fase estacionária. Quando a fase móvel alcança uma seção do papel que não contém soluto, o fenômeno de partição ocorre novamente, só que agora o soluto é transferido da fase móvel para a fase estacionária. Rf = Distância percorrida pela substância Distância percorrida pela fase móvel ds 1 ds 2 dm Rf = ds dm 3

4 SUBSTÂNCIAS SEPARADAS POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL COMPOSTOS HIDRÓFILOS(HIDROSSOLÚVEIS) COMO ÁCIDOS ORGÂNICOS E ÍONS METÁLICOS. Cromatografia por Adsorção Baseia-se nas diferentes afinidades adsorventes da superfície da fase estacionária. É uma cromatografia em que a fase móvel é liquida e a fase estacionária é sólida. O suporte pode ser de alumina ou sacarose para a cromatografia de coluna e vidro ou alumínio para a cromatografia em camada fina. A separação baseia-se nas interações entre moléculas dos solutos da fase móvel liquida e a superfície da fase estacionária sólida Cromatografia de Adsorção Cromatografia de Adsorção Interações:...fenômeno de superfície que ocorre na interfase, implicando interações dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, Ligações de hidrogênio, complexos p. 4

5 Cromatografia de Camada Delgada TECNICA: Pequenas gotas de solução das amostras a serem analisadas são aplicadas em um ponto próximo ao extremo inferior da placa. Cromatografia de Camada Delgada TIPOS: Camada Coluna Deixa-se a placa secar e, então coloca-se a mesma em um recipiente contendo a fase móvel (solvente ou mistura de solventes). A polaridade do solvente deverá ser de acordo com a substância que se deseja separar. Somente a base da placa fica submersa, o solvente começa a molhar a fase estacionária e sobe por capilaridade. Escolha FE e FM Pontos a considerar: 1. Características da amostra 2. O Adsorvente ou fase estacionária Características da amostra 1. Acidez, basicidade, caráter iônico, solubilidade, reatividade com o adsorvente e solventes, 2. Constituição química: ligações duplas, particularmente conjugadas aumentam adsorção. 3. O eluente ou fase móvel 5

6 Características da amostra Ligações de hidrogênio intramoleculares fazem com que o composto seja menos adsorvido que seu isômero. Compostos com pontes de H intramoleculares são menos adsorvidos que seus isômeros. Grupos funcionais aumentam afinidade de adsorção. Este efeito decresce na ordem: -COOH, -CONH2, - OH, -NHCOCH3, -NH2, -OCOCH3, -COCH3, -NO2, - OCH3, -H, -Cl. H O O OH OH COOH 1 2 Com a formação das ligações de H intramoleculares, menos moléculas do composto orto (1), relativamente ao para (2), estarão formando pontes de H com a sílica, daí maior rapidez na eluição Cromatografia de Adsorção - FE Escolha da Fase móvel Inorgânicas: Sílica Alumina ácida, básica e neutra Florisil Orgânicas: Celulose Poliamidas Sephadex Sua escolha depende do adsorvente utilizado, sua atividade e da classe de compostos da amostra. Misturas equieluotrópicas: Misturas de solventes distintas que originam iguais deslocamentos de uma mesma amostra. 6

7 Ordem crescente da capacidade eluotrópica do solvente Éter de petróleo Hexano Tetracloreto de carbono Dissulfeto de carbono Benzeno Diclorometano Clorofórmio Éter dietílico Acetato de etila Éter dipropílico Propanol MeOH Piridina Água Ácido Orgânico diluído Fenol CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA - CCD Aplicações: Para determinar o número de componentes de uma mistura. Para determinar a identidade de duas substâncias. Para monitorar o progresso de uma reação CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA - CCD CCD Para determinar a eficiência de uma purificação. Para determinar o melhor sistema de solvente para uma separação em coluna cromatográfica. Para monitorar uma coluna cromatográfica. UV 254 nm: detecta compostos aromáticos, compostos com duplas conjugadas e alguns compostos insaturados. 7

8 Tipos de Reveladores REVELADORES EM CCD Não-Destrutivos: Câmara de Iodo e UV Destrutivos: Aspergir com Cloreto de Alumínio a 5%, Liebermann-Burchard, Dragendorff e outros. CLASSE Triterpenos e esteróides Flavonóides Alcalóides Compostos insaturados REVELADOR Reagente de Liebermann-Burchard Solução de cloreto de alumínio Reagente de Dragendorff Vapores de iodo DETERMINAÇÃO DO MELHOR SISTEMA DE SOLVENTES PARA SEPARAÇÃO O melhor sistema é aquele que dê um valor de Rf na faixa de 0,4 0,6 para o componente mais rápido na placa. 8

9 CROMATOGRAFIA EM COLUNA Pré-eluição CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC) Carregamento Empacotamento Fracionamento, isolamento e purificação Partição por solventes Métodos cromatográficos Cromatografia de Troca Iônica Separação de macromoléculas com grupos iônicos. As macromoléculas são eluídas com solvente com força iônica definida, podendo ser bem específica. Uso: Àgua deionizada ( resina trocadora de ânions na forma OH e resina trocadora de cátions na forma + H) EX: CU(NO 3 ) 2 Purificação de proteínas Purificação de antibióticos (caldos de fermentação). 9

10 TROCA IÔNICA -FASE ESTACIONÁRIA CROMATOGRAFIA DE TROCA IÓNICA carga Trocadores aniónicos (+) e catiónicos (-) A fase estacionária é altamente carregada, sendo que os componentes com cargas de sinais contrários a estas são seletivamente adsorvidos da fase móvel. Os componentes adsorvidos podem se subseqüentemente eluídos, por deslocamento com outros íons, com o mesmo tipo de carga, porém com maior força de interação com a fase estacionária.. A afinidade entre íons da fase móvel e a matriz podem ser controlados utilizando fatores como ph e a força iônica. TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIAS NA CTI Derivados sulfônicos de copolímeros do estireno e divinilbenzeno. Fortemente catiônica Amina quaternária de copolímeros do estireno e divinilbenzeno. Fortemente aniônica Resinas com o grupo ácido carboxílico. Fracamente catiônica TIPOS DE FASES MÓVEIS NA CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA CTI Soluções tampões (ph 3,0 8,0): Tampão de Fosfato de ph = 8,0. Tampão de Fosfato de sódio de ph = 3,4. Soluções de sal: 0,1 0,2 M de LiCl ou NaCl. Água destilada. Qualquer solvente orgânico 10

11 Vantagens Permite a determinação de espécies iônicas orgânicas e inorgânicas; Sensibilidade a baixas concentrações (µg L-1 ou menos); Tempo de análise (15 minutos); Pequenos volumes de amostra (1 ml). Desvantagens Custos ( ): Equipamento e treinamento Produtos químicos (eluente e regenerante) Mão de obra especializada Técnico capacitado em operar o equipamento e analisar os resultados. Filtração em gel (Exclusão Molecular) Mecanismo Moléculas com diferentes tamanhos podem ser separadas > passando através do gel de diferente tamanho. Moléculas grande não penetram no gel > passam diretamente > saem primeiro Moléculas pequenas > são purificadas V t cv c v c v c v V0 c v c v c v c v V t = vol. total (ocupado pelo gel + solv.) V 0 (=V m ) vol. Fase móvel V t -V 0 vol gel + fase líquida interna 11

12 CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO - CE A fase estacionária mais usada é um gel de dextrano (um polissacarídeo com unidades de glicose), conhecido comercialmente como Sephadex. 12