Eletroforese. Década 1930 O químico sueco Arne Tiselius desenvolveu a eletroforese para o estudo de proteínas de soro sanguíneo.

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1 Eletroforese Um método de separação baseado na diferença de velocidade de migração de espécies carregadas em uma solução tampão sob a influência de um campo elétrico. Década 1930 O químico sueco Arne Tiselius desenvolveu a eletroforese para o estudo de proteínas de soro sanguíneo.

2 Eletroforese -Aplicada a vários problemas de separação de analitos difíceis: ânions e cátions inorgânicos, aminoácidos, catecolaminas, drogas, vitaminas, carboidratos, peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos, nucleotídeos, polinucleotídeos e numerosas outras espécies. -Habilidade única de separar macromoléculas carregadas de interesse da indústria biotecnológica e de pesquisas em biologia e bioquímica.

3 Eletroforese em placa Método clássico que foi usado por muitos anos para separar espécies complexas, de alta massa molecular e de interesse bioquímico e biológico. As separações são feitas sobre uma fina camada plana ou placa de gel poroso semi sólido que contém uma solução tampão aquosa nos seus poros. As amostras são introduzidas como manchas ou faixas sobre a placa e um potencial de corrente contínua é aplicado através da placa por um certo tempo.

4 Eletroforese capilar Faz separações com alta resolução e alta velocidade, em volumes de amostra excepcionalmente pequenos (0,1 a 10nL). Na saída do capilar, as espécies separadas são eluídas, de modo que detectores, como os de HPLC, podem ser usados, em vez da pouco eficiente técnica de manchas da eletroforese em placa.

5 Sistema básico

6 Velocidade de migração A velocidade de migração de uma dada espécie depende da sua carga e também do seu tamanho. As separações são, então, baseadas nas diferenças da relação cargatamanho dos vários analitos em uma amostra. Quanto maior esta razão, mais rápido um íon migra no campo elétrico. e E - velocidade de migração (cm s -1 ) - mobilidade eletroforética (cm 2 V -1 s -1 ) E - intensidade do campo (V cm -1 ) A mobilidade é característica da espécie e do meio.

7 Mobilidade iônica E F A = - 6r + F E = qe F A - força de atrito η - viscosidade r - raio iônico hidratado do íon - velocidade do íon Estado estacionário: F A + F E = 0 6 qe r E F E - força elétrica q - carga elétrica do íon E - campo elétrico 6 q r

8 Mobilidade iônica 6 q r 6 ze r z carga do íon e carga elementar CARACTERÍSTICA DO MEIO e z r CARACTERÍSTICA DO ÍON CONSTANTE

9 Eficiência L T = comprimento do capilar L D = distância da injeção até o detector E V L T E N L 2 D 2 V = voltagem aplicada t m = tempo de migração N = número de pratos t m L D

10 Número de pratos T L V E E 2 2 D L N D m L t Considerando que a difusão longitudinal é a única causa de alargamento da banda m 2Dt T D D D m D DL V L D E L D L Dt L N

11 Efeito Joule Quanto maior o potencial de corrida, maior a velocidade do íon: -Menor tempo de análise -Menor dispersão da banda (maior eficiência) -Maior calor gerado EFEITO JOULE gradientes de temperatura induzem gradientes de densidade podem causar convecção podem misturar bandas já separadas.

12 Como reduzir o efeito Joule? Diminuir o potencial -redução da eficiência e da resolução Diminuir o raio capilar -redução da sensibilidade (detecção) -eventual aumento da adsorção Diminuir concentração do eletrólito de corrida -eventual aumento da adsorção Troca de eletrólito de corrida -interações indesejadas com os analitos

13 Tubo capilar Sílica (SiO 2 ) transparente no UV e visível (sem sustentação) Revestimento de poliimida para aumentar a resistência mecânica transparente, mas avermelhado (tem menor condutividade térmica do que a sílica)

14 Fluxo eletroosmótico (EOF) Quando um potencial alto é aplicado através de um tubo capilar contendo uma solução tampão, usualmente ocorre um fluxo eletroosmótico, no qual o solvente migra em direção ao cátodo ou ao ânodo. CAUSA: Dupla camada elétrica interface sílica solução Em ph > 3, a parede interna do capilar de sílica fica carregada negativamente devido à ionização de grupos silanóis superficiais (Si-OH).

15 Fluxo eletroosmótico

16 Fluxo eletroosmótico

17 Fluxo eletroosmótico x fluxo laminar Fluxo laminar Início Fluxo eletroosmótico

18 Fluxo eletroosmótico A velocidade do fluxo eletroosmótico depende de: densidade de carga na superfície interna do capilar (ph e espécies adsorvidas) espessura da dupla camada elétrica viscosidade da região da dupla camada elétrica (solvente, aditivos, temperatura) campo elétrico

19 Velocidade do fluxo eletroosmótico E eo

20 Velocidade total ( ) e eo E A ordem de eluição em uma separação eletroforética típica é: em primeiro lugar, o cátion mais rápido (1), seguido sucessivamente pelos cátions mais lentos (2); em seguida, todas as espécies neutras (3) em uma única zona e finalmente, o ânion mais lento (4) seguido sucessivamente pelos ânions mais rápidos (5).

21 Controle do EOF Ligação Covalente através de reações de silanização Adição de surfactante catiônico ao tampão Parede do capilar fica carregada positivamente Inversão da direção do fluxo

22 Equipamento básico

23 Introdução da amostra O segmento da amostra não deve ocupar mais que 10% do comprimento do capilar. Devido às dimensões do capilar, válvulas injetoras são proibidas. Estratégias mais empregadas: -Injeção por pressão -Injeção eletrocinética

24 Introdução da amostra Injeção eletrocinética: -introdução de amostra no capilar sob ação de campo elétrico (combinação de migração iônica e fluxo eletroosmótico) -discrimina a injeção de quantidades maiores de íons com maior mobilidade em relação a íons mais lentos Injeção por pressão: -diferença de pressão (aplicação de vácuo na extremidade do detector, por pressurização da amostra ou elevando a sua extremidade)

25 Detecção São utilizadas técnicas já conhecidas adaptadas às condições de eletroforese capilar Muitos foram herdados de HPLC Exemplos: métodos de absorbância, de fluorescência, eletroquímicos, espectrometria de massas entre outros Principal problema: dimensões reduzidas dificuldades mecânicas e baixa sensibilidade ou relação sinal/ruído

26 Detecção espectrofotométrica Detecção feita na coluna Sílica é transparente A camada de poliimida absorve na região do UV-Vis remoção por aquecimento, raspagem ou dissolução

27 Exemplo

28 Tipos de células (a) 150m (b) 50m Caminho óptico: 3 mm

29 Detecção indireta Um cromóforo iônico é colocado no tampão da eletroforese O detector recebe um sinal constante devido à presença dessa substância O analito desloca alguns desses íons, de modo que o sinal do detector diminui durante a passagem de uma banda de analito pelo detector O analito é, então, determinado pelo decréscimo de absorbância

30 Exemplo

31 Modalidades de eletroforese capilar Eletroforese capilar por zona (CZE) Eletroforese capilar em gel (CGE) Isotacoforese capilar (CITP) Focalização isoelétrica capilar (CIEF) Eletrocromatografia capilar (CEC) Cromatografia eletrocinética micelar (MECC)

32 Eletroforese capilar por zona A composição do tampão é constante ao longo da região de separação. O campo aplicado faz com que cada um dos diferentes componentes iônicos da mistura migre de acordo com a sua mobilidade e se separe em zonas. A mais popular das técnicas.

33 Eletroforese capilar em gel A solução aquosa é substituída por gel. Mecanismo: peneiramento em gel, isto é, moléculas menores têm maior mobilidade. Exemplos: agarose, poliacrilamida

34 Isotacoforese capilar Todas as bandas de analito migram na mesma velocidade. A amostra é injetada entre 2 soluções tampão. - componentes da amostra se separam em zonas (de acordo com a sua mobilidade) - todas essas zonas se movem com a mesma velocidade - na quantificação se mede os comprimentos das zonas

35 Focalização isoelétrica capilar Empregada para separação de espécies anfipróticas, como aminoácidos e proteínas que contêm um grupo carboxílico fraco e um grupo amina, que é uma base fraca. Um composto anfiprótico é uma espécie que, em solução, é capaz de doar e receber prótons.

36 Cromatografia eletrocinética micelar Técnica baseada na utilização de meio micelar. Micelas iônicas possuem mobilidade diferente de zero. Uma espécie neutra na solução caminha em direção ao pólo negativo. Retida em uma micela negativa, ela caminha em direção ao pólo positivo.

37 Vantagens e desvantagens VANTAGENS: Elevada frequencia analítica (rapidez) Versatilidade Baixo custo - Baixo consumo de amostras, reagentes e solventes Desempenho analítico satisfatório Excelentes separações e resoluções Possibilidade detecção on line DESVANTAGENS: Não se aplica a todos os tipos de compostos, como: Voláteis, apolares e/ou de baixa massa molar (adequados para CG) Polímeros iônicos de massa molar alta

38 Exercício Um determinado cátion inorgânico tem mobilidade eletroforética de 4,31x10-4 cm 2 s -1 V -1. Este mesmo íon tem um coeficiente de difusão de 9,8x10-6 cm 2 s -1. Se este íon é separado de outros cátions por eletroforese capilar por zona com um capilar de 50,0 cm, qual seria o número de pratos N esperados para a aplicação de 5,0 kv? O que é fluxo eletrosmótico? Por que ele ocorre?