ELETROFORESE CAPILAR PRINCÍPIOS E APLICAÇÕES. PROF. Dr. MARCONE AUGUSTO LEAL DE OLIVEIRA

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1 ELETROFORESE CAPILAR PRINCÍPIOS E APLICAÇÕES PROF. Dr. MARCONE AUGUSTO LEAL DE OLIVEIRA

2 EXPERIMENTO DE TISELIUS (1937) Separação de parcial de proteínas constituintes do soro sanguíneo (Prêmio Nobel de 1948) T = 0.239Q 4k r 2 T diferença entre o centro e a parede do tubo Q densidade de potência (Watts/m 3 ) K condutividade térmica r raio do tubo

3 1930 FRONTEIRA MÓVEL A. TISELIUS 1948 PRÊMIO NOBEL Uppsala University, Suécia Colunas de 300 µm S. HJERTÉN Uppsala University, Suécia 1979 Capilares de 100 µm F. M. EVERAERTS Separação de 16 ânions Eindhoven University of Technology, Holanda 1981 Capilares de 75 µm J. JORGENSON FSCE teoria simplificada University of North Carolina, EUA LIF detector de fluorescência induzida por laser Detectores Eletroquímicos R. ZARE Stanford University, EUA E. YEUNG Iowa State University, EUA E. EWING Pennsylvania State University, EUA 1984 MEKC S. TERABE Kyoto University, Japão 1986 INSTRUMENTOS COMERCIAIS 1987 CGE B. KARGER Northeastern University, EUA 1991 CEC KNOX e GRANT separação de HPA s University of Edinburg, Escócia 1997 MICROCHIP TECHNOLOGY

4 PERFIL DE TEMPERATURA NO INTERIOR DE UM CAPILAR CENTRO PAREDE REVESTIMENTO DE POLIIMIDA TEMPERATURA T = 0.239Q 4k r 2 r 1 r 2 r DIÂMETRO, µm

5 ELETROFORESE CAPILAR (CE): CONCEITO Injeção + - Comprimento efetivo + Cátion Neutro Detector mau - Ânion Tempo, min

6 INSTRUMENTAÇÃO 1-Fonte de alta tensão 2-Eletrodos 3-Reservatórios para eletrólito e amostra 4-Capilares 5-Injeção 6-Compartimento estabilizado termicamente 7-Detectores

7 PROPRIEDADES DO CAPILAR - sílica fundida (dióxido de silício amorfo SiO 2 ) revestido com poliimida ou acrilamida (15 µm); - dimensões precisas (25 a 75 µm d.i. x 330 µm d.e.); - alta constante dielétrica; - baixa condutividade elétrica; - resistência mecânica; - maleabilidade; - resistência ao ataque químico; - alta transmissão óptica para um intervalo apreciável de comprimento de onda (190 a 990 nm); - presença de FLUXO ELETROOSMÓTICO;

8 SÍLICA FUNDIDA Si OH + H 2 O pk a = 5,9 Si O - + H + O Si OH Si O Si O Si O Si O Si O O H Si O O H O Si O Si O O: Si O Si Si O SUPERFÍCIE O Si OH O OH Si OH SILANOL silanóis vicinais (ponte de hidrogênio) silanol dissociado SILOXANO silanol isolado silanóis geminais SOLUÇÃO

9 HIDROSTÁTICA h MODOS DE INJEÇÃO P vácuo ELETROCINÉTICA +

10 INJEÇÃO HIDRODINÂMICA INJEÇÃO ELETROCINÉTICA

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13 DETECTORES UTILIZADOS EM CE Limites de detecção aproximados Fluorescência Amperometria Condutividade Índice de refração Detector Absorvância no UV/vis Absorvância indireta Fluorescência indireta fluorescência induzida por laser Espectrometria de massas N o de Mol Molaridade* Radiométrico * Depende sobretudo do volume de amostra injetado

14 I 0 I T Fonte de luz Capilar Fotodetector 1 A = log = abc T

15 LEI DE BEER I 0 I SOLUTO ε = 10 3 L mol -1 cm 1 C = 1 mmol L -1 = CUBETA DE 1 cm A = 1 I 0 log = A = ε b C I FATOR DE 200 CAPILAR DE 50 µm A = 0,005

16 MANEIRAS DE AUMENTAR A SENSIBILIDADE EM DETECÇÃO POR UV/VIS CAPILAR RETANGULAR CÉLULA EM Z Bubble i.d. CÉLULA EM FORMA DE BOLHA CÉLULA DE MULTIREFLEXÃO

17 Injeção DETECÇÃO DIRETA POR UV/vis + - Comprimento efetivo A B A, B e C com alta absortividade molar Detector mau C Tempo, min

18 DETECÇÃO INDIRETA Injeção Zona escura do solvente + - Zona translúcida do solvente Zona translúcida do solvente + - Cátion Ânion Baixa absortividade molar Detector

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22 MECANISMO DE SEPARAÇÃO MOBILIDADE ELETROFORÉTICA MOBILIDADE ELETROOSMÓTICA MOBILIDADE OBSERVADA FLUXO NORMAL FLUXO INVERTIDO MOBILIDADE EFETIVA

23 MOBILIDADE ELETROFORÉTICA F r a E + F r e F = 6 π ηr atrito i v i F elétrica = Z i e E vi µ i = E Mobilidade do íon correspondente a sua velocidade limite v i em um campo elétrico de valor unitário Z e E = i 6 π ηr i v i Z e i µ i = = 6 π ηri q 6 π ηr i

24 Injeção C B A - + Comprimento efetivo Z e µ = i = i 6 π η r i q 6 π η r i Detector mau Tempo, min

25 MOBILIDADE ELETROOSMÓTICA-FLUXO NORMAL IHP OHP PLANO DE CISALHAMENTO - E SUPERFÍCIE CAMADA COMPACTA CAMADA DIFUSA SOLUÇÃO +

26 Si Si Si Si Parede interna do capilar ânodo cátodo Camada compacta + - Plano de cisalhamento Camada móvel Fluxo eletrosmótico (EOF) ζ = 4πδe ε v osm = εζe 4πη µ osm = εζ 4πη Potencial zeta Velocidade eletroosmótica Mobilidade eletroosmótica δ α 1 C FI= 1 2 i 2 c i z i µ osm = v osm E

27 PERFIL RADIAL DA VELOCIDADE FLUXO ELETROOSMÓTICO FLUXO LAMINAR

28 FLUXO ELETROOSMÓTICO EM DIFERENTES MATERIAIS MOBILIDADE ELETROOSMÓTICA (10 4 cm 2 V -1 s -1 ) PYREX TEFLON SÍLICA ph

29 MOBILIDADE OBSERVADA v = v + obs ef v osm v µ = i i E µ = + µ µ obs ef osm

30 mau Injeção µ osm Detector Tempo, min µ µ ef osm v obs v obs = v osm µ ef - µ osm v obs

31 CO-ELETROSMÓTICO VETOR µ ef DO ANALITO E A µ osm ESTEJAM NA MESMA DIREÇÃO E SENTIDO µ ef µ osm µ = + µ µ obs ef osm

32 CONTRA-ELETROSMÓTICO VETOR µ ef E µ osm ESTEJAM NA MESMA DIREÇÃO, SENTIDOS CONTRÁRIOS µ ef µ osm µ = + µ µ obs ef osm

33 DETECTOR µ ef INLET OUTLET µ osm

34 DETECTOR µ ef INLET OUTLET µ osm

35 DETECTOR µ ef INLET OUTLET µ osm

36 MOBILIDADE ELETROOSMÓTICA - FLUXO INVERTIDO IHP + + CAMADA COMPACTA OHP CAMADA DIFUSA PLANO DE CISALHAMENTO SOLUÇÃO E + -

37 DETECTOR INLET µ ef OUTLET µ osm

38 - + Comprimento efetivo Detector

39 A B H = A + + u x Cu x B C

40 MODOS DA ELETROFORESE ELETROFORESE DE ZONA (CZE ou FSCE) ELETROCROMATOGRAFIA MICELAR (MECC ou MECK) CROMATOGRAFIA ELETROCINÉTICA EM MICROEMULSÃO (MEEKC) ELETROFORESE CAPILAR EM GEL(CGE) FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA CAPILAR (CIEF) ISOTACOFORESE CAPILAR

41 µ = ef q 6 π η r i

42 µ = ef q 6 π η r i

43 ELETROFEROGRAMAS DE ALGUMAS AMOSTRAS DE MEL Eletrólito PDC 20 mm, CTAB 0,5 mm, ph=12,1, -20 kv, 280 nm, capilar de sílica 87 cm total (80 cm até detector) x 50µm ID.

44 DETERMINAÇÃO INDIRETA DE ÁCIDOS GRAXOS DE CADEIA CURTA E MÉDIA ácido acético (C2) 2- ácido propiônico (C3) 3- ácido butírico (C4) 4- ácido valérico (C5) 5- ácido capróico (C6) 6- ácido caprílico (C8) 7- ácido cáprico (C10) min

45 DETERMINAÇÃO INDIRETA POR UV DE ÁCIDOS GRAXOS CIS-TRANS C12:0 C13:0 C14:0 C18:3ccc C18:2cc C16:0 C18:2tt C18:1c C18:0 C18:1t min

46 ANÁLISE INDIRETA DE ÁCIDOS GRAXOS LIVRES EM AMOSTRA DE AZEITE DE OLIVA ácido oleico (C18:1c) 2-ácido palmítico (C16:0) 3-ácido linoleico (C18:2cc) min

47 DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS POR DETECÇÃO CONDUTOMÉTRICO

48 DETERMINAÇÃO DE FLUOROQUINOLONAS Moxifloxacina 2-Gatifloxacina 3-Sparfloxacina 4-Ciprofloxacina 5-Levofloxacina min

49 DETERMINAÇÃO DE LOZARTAN ASSOCIOADO A DIURÉTICOS Losartan 2- Clortalidona 3-Hidroclorotiazida min

50 MEKC MEEKC FSCE NACE CGE ELETROFORESE CAPILAR CEC CITP CIEF CAPILARES DE SÍLICA FUNDIDA ( mm diâmetro, cm comprimento) DISSIPAÇÃO EFETIVA DO CALOR RAZÃO ELEVADA ÁREA/VOLUME ALTA RESISTÊNCIA ELÉTRICA (10 9 ohms) ALTA TENSÃO (5-30 kv) CAMPO ELÉTRICO ELEVADO ( V/cm) CORRENTE BAIXA (< 200 µa) ALTA EFICIÊNCIA DE COLUNA ( pratos) ALTA RESOLUÇÃO E CAPACIDADE DE PICO TEMPO DE ANÁLISE CURTO VÁRIOS MODOS DE SEPARAÇÃO (FSCE, NACE, MEKC, MEEKC, CEC, CGE, CIEF, CITP) EXTENSA GAMA DE APLICAÇÕES íons, compostos orgânicos, quirais, biomoléculas MEIO AQUOSO PEQUENO VOLUME DE AMOSTRA 1-50 nl volume injetado FORMATO INSTRUMENTAL INJEÇÃO E DETECÇÃO EM FLUXO COM COLETA DE FRAÇÕES OTIMIZAÇÃO SIMPLIFICADA DAS CONDIÇÕES XPERIMENTAIS