Métodos Eletroforéticos de Análise
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- Wagner da Mota Damásio
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1 Microfluídica 27/11/12 Métodos Eletroforéticos de Análise Aula 04 Eletroforese Capilar em Solução Livre Instrumentação 1 bjetivos - Compreender o funcionamento do mecanismo de separação relacionado à separação eletroforética em solução livre. - Compreender os efeitos no fluxo eletrosmótico, a dependência do potencial elétrico aplicado e os métodos de determinação. - Diferenciar os termos: mobilidade aparente, mobilidade eletroforética e mobilidade eletrosmótica. - Diferenciar os termos: polaridade normal e polaridade invertida. - Familiarizar com a instrumentação básica. 2 Eletroforese Capilar 3 Detector Controle Capilar Fonte de Alta Tensão Tampão Amostra L T = cm Tampão 1
2 Sinal (U.R) Sinal do Detector (U.R.) 4 Eletroforese Capilar 1,3 Detector 1,2 Controle Capilar 1,1 1,0 Tampão Fonte de Tempo (min) Alta eletroferograma Tensão Amostra L T = cm Tampão Efeito do Potencial Aplicado 5 2,0 1,5 Ca 2 Na Mg2 K Li 5,0 kv 1,0 0,5 0,0-0,5 7,5 kv 10 kv 20 kv 25 kv Tempo (min) Íons em solução Migração Difusão 6 Fonte de Potencial Migração F zee 2
3 z / r i i Íons em solução Migração F: Força elétrica F R : Força de relaxação F : Força de retardamento 7 F Deformação da atmosfera iônica F R F F F Total F ( F R ' F ) Mobilidade Eletroforética (m ep ) 8 E F v ep F e v ep E m ep ze 6r Mobilidade Eletroforética ze me 6r Ba 2 Ca 2 Cd 2 Ce 3 Co 2 Cs Cu 2 Dy 3 Er 3 Eu 3 Gd 3 Ho 3 K La 3 Li Mg Mg 2 2 Mn 2 Na Nd 3 NH 4 Ni 2 Pb 2 Pr 3 Rb Sm 3 Sr 2 Tm 3 Yb 3 Zn 2 3
4 tempo de migração (min) Mobilidade Eletroforética 10 n plug capilar l (comprimento até o detector) L (comprimento total) Detector s v t v l t m Mobilidade Eletroforética 11 v l t m V v mee me L (1) (2) Combinando-se (1) e (2), temos: l t m V me L m e ll t V m t m ll m V e Tempo de Migração Potencial (kv) 4
5 Corrente (ma) Quanto maior o potencial, mais rápida a análise? U = R x i y = ax b a = 1/R Potencial (kv) Fluxo Eletrosmótico (EF) Estrutura da sílica fundida Si Si Si Si H Silanol isolado H Si Si Silanóis vicinais Si Si Si Si H - Silanol dissociado Si Si Si Si Siloxano H Silanóis geminais H 14 Fluxo Eletrosmótico (EF) Fenômenos Eletrocinéticos 15 Eletrosmose Potencial de fluxo (streaming potential) ldham, K. B.; Myland, J. C.; Fundamentals of Electrochemical Science, Academic Press, San Diego, CA, USA,
6 Fluxo Eletrosmótico (EF) 16 IHP HP CAPILAR H H H H H - - H H - PC (z ) Fluxo Eletrosmótico (EF) 17 Fluxo Laminar (pressão) EF Fluxo Eletrosmótico (EF) 18 Fatores que afetam o EF ph (z) Potencial Aplicado (E) Concentração (ou Força Iônica) do Tampão (z) Temperatura () Solventes rgânicos (, e, z) Modificação da Superfície do capilar Aplicação de um potencial radial externo 6
7 Fluxo Eletrosmótico (EF) 19 Fatores que afetam o EF ph m EF / 10-4 cm 2 V -1 s -1 Fluxo Eletrosmótico (EF) 20 Fatores que afetam o EF Concentração m EF / 10-8 m 2 V -1 s Fluxo Eletrosmótico (EF) 21 Modificação e Controle do EF Modificação da Superfície do Capilar Alterações Dinâmicas Adição de Tensoativos (Surfactantes) Ligação Covalente Através de reações de silanização 7
8 Modificação e Controle do EF 22 Alterações Dinâmicas - Adição de Tensoativos (Surfactantes) Modificação e Controle do EF 23 Brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) N N N N N N N N Como medir o EF? 24 Sinal de um marcador Neutro Monitoramento da corrente que flui pelo capilar ll m eof t V eof 8
9 Monitoramento do EF 25 Monitoramento do EF 26 HV Detector 0 V (a) (b) (c) Monitoramento do EF 27 PT x bjective Microchip HVPS Diaphragm & Len Filter White LED 5,5 V dc 9
10 PT101 utput / V m eof m a = 0 Current / ma Monitoramento do EF 28 Monitoramento do EF PT101 Current time / s Mobilidade Aparente 30 ma mef meof m a > 0 m ef m eof m a m ef m a m eof m a < 0 m ef 10
11 Controle de Temperatura 31 Efeito Joule Dispersão (s 2 ) 32 Efeito Joule Decréscimo no campo elétrico Efeito proporcional na geração de calor Reduz a eficiência e resolução Redução do diâmetro do capilar Decréscimo significativo na corrente Diminui a sensibilidade Pode causar aumento na adsorção Decréscimo na concentração do tampão Decréscimo proporcional da corrente Pode causar aumento na adsorção Controle ativo da temperatura Termostatos; remoção de calor do capilar Resolução 33 tm2 tm 1 R 2 w1 w2 1 R 4 N m _ m t m2 t m1 w b1 w b2 1 R 4 2 V m _ D m m EF 1/2 11
12 Fluorescência (ua) Fluorescência Resolução 34 PDMS Nativo 0,1 URF R=1,9 R=1,8 R=2,7 R=2,6 R=2,4 R=2,7 R=3, Tempo (s) Resolução 35 0,9 0,8 Poliéster-toner 0,7 0,6 R = 2,3 R = 1,9 R = 1,6 R = 1,4 R = 1,5 R = 1,6 0,5 R = 2,7 0,4 0,3 0, Tempo (s) Eficiência da Separação 36 t m N 16 wb 2 12
13 Fluorescência (URF) Fluorescência (URF) Eficiência da Separação 37 N t m 16 wb 2 0,3 0,2 Toner preto (Imp. Monoc.) 2,0 1,5 Toner preto (Imp. Colorida) 1,0 0,1 0,5 0, Tempo (s) 0, Tempo (s) Seletividade (a) 38 Tampão: Borato 100 mm; Capilar 25 mm, 17 cm até o detector; Potencial 30 kv; Detecção UV em 200 nm. Análise de Cátions 39 m m m a ef eof Após uma análise eletroforética, a mobilidade aparente de uma espécie catiônica foi igual a 1,610-4 cm 2 V -1 s -1. Considerando o valor de m eof = 1,010-4 cm 2 V -1 s -1, calcule o valor da mobilidade eletroforética da espécie analisada. 13
14 Fluorescência (URF) Análise de Ânions 40 m m m a ef eof m a < 0??? Análise de Ânions 41 0,4 0,3 0,2 0,1 Poliéster-toner Fluxo Normal m app = m ep m eof 0,6 0,4 0,2 m eof FL m ep 3,0x10 Poliéster-toner Fluxo Invertido 4 CM 5 1,0 x10 m ap??? 0, Tempo (s) 0, Polaridade Normal 42 CAPILAR H H H H H - - H H - 14
15 Fluorescência (URF) Polaridade Invertida 43 CAPILAR H H H H H H H - - Análise de Ânions 44 0,4 0,3 Poliéster-toner Fluxo Normal 0,6 FL Poliéster-toner Fluxo Invertido 0,2 m app = m ep m eof 0,4 CM 0,1 0,2 0, Tempo (s) 0, Instrumentação Básica 45 Fonte de Alta Tensão D Pt Reservatórios 15
16 Instrumentos Comerciais Perkin Elmer Applied Biosystems 1989 P/ACE Beckman Coulter 1993 P/ACE 5000 Instrumentos Comerciais 47 P/ACE MDQ Beckman Coulter HP 3D CE System Agilent Technologies Instrumentos Comerciais 48 Capline System Knauer CE-L1 CE-Resources 16
17 360 mm Instrumentação Básica 49 Capilares Materiais: Sílica Fundida, PTFE, PEEK Comprimento: 20 a 70 cm Diâmetro Interno: 20 a 75 mm Fonte de Alta Tensão Potencial: 0-30 kv Corrente: 400 ma Potência: 12 W 75 mm Controle de Temperatura Injeção de Amostra Detecção Coleta de Frações Injeção da Amostra 50 A introdução da amostra no capilar pode ser feita de duas maneiras: Aplicando-se pressão ao capilar Injeção Hidrodinâmica Pressão positiva ou negativa Gravidade Utilizando-se campo elétrico Injeção Eletrocinética Injeção da Amostra 51 Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Pressão) P P 4 Pr t V 8L V : Volume Injetado P : Gradiente de Pressão r : Raio do capilar t : Tempo de Injeção : Viscosidade L : Comprimento do Capilar 17
18 Injeção da Amostra 52 Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Gravidade) 4 rghr t V 8L h V : Volume Injetado r : Densidade g : Aceleração da Gravidade h : Diferença entre os níveis r : Raio do capilar t : Tempo de Injeção : Viscosidade L : Comprimento do Capilar Injeção da Amostra 53 Injeção Eletrocinética da Amostra Fonte AT Vctr Q 2 m ep m eo L Q : Quantidade de Material Injetado c : Concentração r : Raio do Capilar t : Tempo de Injeção m ep : Mobilidade Eletroforética m eo : Mobilidade do FE L : Comprimento do Capilar Injeção da Amostra 54 Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias) t 0 = 0 E K Na H
19 Injeção da Amostra 55 Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias) t 1 > 0 E K Na H 2 0 Injeção da Amostra 56 Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias) Injeção da Amostra 57 Aspectos Práticos volume injetado não deve exceder 10 % do volume total do capilar. Isto corresponde a um volume em torno de 50 a 100 nl. Na injeção eletrocinética há a discriminação da amostra. Variações na composição da amostra afetam a quantidade injetada. Padrão interno 19
20 360 mm Estratégias de Detecção 58 Introdução 59 Volume de amostra : Quantidade de amostra : Dimensões da cela de detecção : nl pmol-fmol mm < 2 mm 75 mm Introdução Fotométrica Absorção UV-visível Fluorescência Quimiluminescência Índice de Refração Lentes Térmicas SPR Infravermelho 60 Eletroquímica Amperométrica Condutométrica Potenciométrica Voltamétrica Radiométrica Acoplamento com outras técnicas ICP, ICP-MS, RMN, MS 20
21 Introdução 61 Detector LD / mol L -1 UV-vis UV-vis (indireto) Fluorescência Fluorescência (Indireto) Fluorescência Induzida por Laser (LIF) Espectrometria de Massa Amperometria Condutividade Índice de Refração Introdução 62 Tempo de resposta do detector Taxa de aquisição de dados Tempo de integração ponto a cada segundo. segundos. Introdução 63 Detecção Direta ou Indireta?? 21
22 Métodos Ópticos 64 Absorção UV-vis 65 b I o I T I I 0 A log T ebc Absorção UV-vis 66 22
23 Absorção UV-vis 67 Detecção UV-vis mono-canal Absorção UV-vis 68 Detecção UV-vis mono canal - Exemplos Absorção UV-vis 69 Detecção UV-vis multi-canal 23
24 Absorção UV-vis 70 Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos Absorção UV-vis Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos 71 Métodos Eletroquímicos 72 24
25 Métodos Eletroquímicos 73 Manipulação dos eletrodos Reprodutibilidade Influência do campo elétrico de separação Detecção eletroquímica em CE Seletividade Adsorção irreversível Métodos Eletroquímicos 74 Amperométricos Constante Pulsado Voltamétricos Potenciométricos Condutométricos Com contato Sem contato Métodos Eletroquímicos Células Eletroquímicas n-column Capilar e 2 End-Column wall-jet 75 Capilar WE Capilar WE e 1 ff-column Desacoplador n-capillary Contato Cola Capilar WE Capilar WE Membrana 25
26 Métodos Eletroquímicos 76 Detectores Condutométricos Universais Com contato (baixa freqüência) Sem Contato (alta freqüência) LD mol L -1 Baixo Custo de implementação pera em condições de alta eletrodispersão Com Contato Sem Contato V t i(t) R V ( t) Ri( ) 0 t V t i(t) R V ( t) Ri( ) 0 t Métodos Eletroquímicos Detecção Condutométrica sem Contato 77 da Silva, J. A. F.; Guzman, N.; do Lago, C. L.; J. Chromatogr. A 2002, 942, Detecção Condutométrica sem Contato 78 C e X c / k f / Hz C w1 R s C w2 1 X C 2fC Capilar 26
27 Resposta / V Detecção Condutométrica sem Contato 79 da Silva, J. A. F.; do Lago, C. L.; Anal. Chem. 1998, 70, Detecção Condutométrica sem Contato 80 Separação de alguns álcoois alifáticos por MEKC EF Picos 1. 2-propanol 2. 1-propanol 3. 2-metil-2-propanol 4. 2-butanol 5. 2-metil-1-propanol 6. 1-butanol 7. 2-metil-2-butanol 8. 3-metil-1-butanol 9. 1-pentanol Tempo / min Tampão: fosfato 50 mm, SDS 50 mm, ph 6,9. Injeção por gravidade (10 cm por 30 s) da Silva, J. A. F.; do Lago, C. L.; Electrophoresis 2000, 21, Materiais dos Eletrodos Detecção Amperométrica 81 Carbono (Fibra, disco, vítreo) Diamante dopado Metais (Pt, Cu, Ni, Au) Modificados (Hg, Pd, Sn, Ru, Co Ftalocianinas, óxidos, enzimas, etc.) Número e Tipo dos Eletrodos Simples Duplo Array Microdisco Tubular Banda Sinal de Estímulo (Potencial) Configuração da Celula Eletroquímica 2 Eletrodos : WE, RE 3 Eletrodos : WE, RE, AE Contínuo (AD) Pulso (PAD) 27
28 Detecção Amperométrica 82 Detecção Amperométrica 83 Detecção Amperométrica 84 28
29 Detecção Amperométrica 85 DA: Dopamina NE: Norepinefrina Epi: Epinefrina IP: Isoproterenol Detecção Amperométrica 86 Métodos Acoplados CE-MS 87 29
30 CE- Espectrometria de Massas 88 Electrospray concentração local de cargas cela eletroquímica CE- Espectrometria de Massas 89 Electrospray solução capilar metálico eletrodo metálico CE- Espectrometria de Massas 90 Electrospray 30
31 CE- Espectrometria de Massas 91 Electrospray CE- Espectrometria de Massas 92 Electrospray evaporação fissão CE- Espectrometria de Massas 93 31
Métodos Eletroforéticos de Análise
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